重组E.coli发酵产酪氨酸酚裂解酶的最优条件
重组 E.coli 发酵产酪氨酸酚裂解酶的最优条件
摘要：左旋多巴是治疗帕金森氏病的首选药物, 生物酶法合成左旋多巴具有工艺简单、条件
温和、立体选择性高和环境友好等优点。本论文以实验室前期构建的表达具核梭杆菌
(Fusobacterium nucleatum) TPL (Fn-TPL) 的重组大肠杆菌为基础, 采用单因素实验通过对 5 L 发
酵罐发酵工艺优化以及补料策略的研究, 确定了分批发酵的工艺参数:pH 6. 5, 诱导温度 30℃, 诱
导剂乳糖 20 g/L。在 5 L 发酵罐中, 进一步研究了 10 mL/h、20 mL/h、30 mL/h 三个速率的恒速
流加对菌体生物量和 TPL 酶活的影响。结果表明, 补料速率为 20 mL/h 时, 生物量最高为 30. 43
g dcw/L, 体积酶活最高为 9 420 U/L, 较摇瓶发酵培养活力提高了 3. 3 倍。
关键词：酪氨酸酚裂解酶; 左旋多巴; 发酵工艺优化; 分批补料培养;
Study on fermentation process for recombinant tyrosine phenol lyase
TANG Xiaoling YANG Jian WANG Zhichao SUO Hui ZHENG Renchao
Institute of Biological Engineering, Zhejiang University of Technology
Abstract：Levodopa ( 3, 4-dihydroxyphenyl-l-alanine, L-DOPA) is the first choice of drug for the
treatment of Parkinson's disease. Compared with plant extraction and chemical synthesis, biosynthesis
of L-DOPA has the advantages of simple process, mild reaction condition, high stereoselectivity and
environmental friendliness. In this study, the fermentation process was optimized for the recombinant
E. coli strain harboring TPL from Fusobacterium nucleatum ( FnTPL) in a 5 L fermenter. The process
parameters for batch fermentation were determined as follows: pH 6. 5, induction temperature 30 ℃
and inducer lactose 20 g/L. Fed-bath process with constant feeding was further applied and the results
indicated that with 20 mL/h of constant feeding strategy, both the biomass and volumetric activity of
Fn-TPL reached highest, which were 30. 43 g dcw/L and 9 420 U/L, respectively.
帕金森综合症 (Parkinson’s disease, PD) , 是一种常见的中老年人神经系统变性疾病。据报道, 40
岁以上人群中发病率超过 0.1%[1]。在国内调查发现, 近年来国内 6个城市 63 195 人口的资料表
明, 帕金森病患病率为 57/10 万[2]。在世界范围内大多数的研究调查发现, 帕金森病的患病率为
0.1%~0.3%, 其中在老年人群中患病率更高[3]。左旋多巴是多巴胺的前体药物, 能够通过血脑屏
障, 到达中枢神经系统, 并在脱羧酶的作用下, 转变为多巴胺, 进而发挥治疗帕金森氏病的作用
[4]。目前, 用于合成左旋多巴的方法包括天然植物提取法、化学合成法和生物酶催化法。提取
法因原料来源较少、提取步骤复杂繁琐等因素的限制, 产量小、生产成本高, 难以实现大规模生
产, 远不能满足市场需求。化学合成过程中需要大量的金属催化剂, 并且反应条件苛刻, 产物转
化率及手性选择性低, 同时具有成本高、环境不友好等问题[5], 在工业生产上受到限制。生物酶
法合成左旋多巴具有工艺简单、条件温和、立体选择性高和环境友好等优点, 越来越受到青
睐。酪氨酸酚裂解酶 (tyrosine phenol lyase, TPL, E.C.4.1.99.2) , 又名 β-酪氨酸酶, 它是一类磷酸
吡哆醛 (pyridoxal-5'-phosphate, PLP) 依赖型裂解酶。TPL 能够催化 L-酪氨酸发生 α, β-消去反应,
生成丙酮酸、苯酚和氨。此反应为可逆反应, 若以邻苯二酚替代苯酚, 该酶可逆向催化生成左旋
多巴[6,7]。和氨基酰化酶、酪氨酸酶、羟化酶等具有催化合成左旋多巴能力的酶相比, TPL 合
成左旋多巴催化效率高, 过程不需要添加NADH 等辅助因子[8,9,10]、成本低, 有利于左旋多巴
的工业化生产。
本实验室前期构建了表达有具核梭杆菌 TPL 的重组 E.coli BL21 (DE3) /pET-28b-Fn-TPL, 底物转
化率高, 左旋多巴合成能力较强。但由于该重组菌在发酵过程中生物量较低, 产酶水平不高, 限
制了工业化应用。为了进一步提高酪氨酸酚裂解酶活力和产量, 适应工业化生产需求, 本论文对
来源于具核梭杆菌的 Fn-TPL 发酵工艺进行了研究。目前, 补料工艺已是工业发酵领域中研究最
多, 最广的技术之一[11], 本实验通过单因素试验, 在5 L 发酵罐中研究了诱导温度、诱导剂浓度
及p H 对菌体生长及产酶的影响。确定最佳的发酵培养条件后, 为了进一步探究补料策略对重
组E.coli Fn-TPL 发酵的影响, 通过考察不同速率的恒速流加对重组 E.coli 发酵产酪氨酸酚裂解
酶的影响, 确定最优发酵条件。
1 实验部分
1.1 材料
1.1.1 菌种
重组酪氨酸酚裂解酶产生菌 E.coli BL21 (DE3) /pET-28b-Fn-TPL, 由本实验室构建并保藏。
1.1.2 仪器及试剂
丙酮酸钠、邻苯二酚、磷酸吡哆醛 (PLP) 为上海阿拉丁生化科技有限公司产品;左旋多巴标准品
由浙江杭州手心制药有限公司提供;进口蛋白胨、进口酵母粉、琼脂粉购买自北京 Oxoid 公
司;15-150 kDa 双色预染蛋白 Marker 、卡那霉素(Kan) 、异丙基-β-d- 硫代半乳糖苷(IPTG) 购买
自上海生工生物技术股份有限公司。
往复式水浴摇床(上海精密科学仪器有限公司) ; 气相色谱仪 (Agilent Technologies) ;高速冷冻离
心机 (德国Beckmin 公司) ; 超净工作台(苏州净化设备有限公司) ;Bio-tech 5 L 立式发酵罐 (上海
保兴生物器材有限公司) 。
1.1.3 培养基与缓冲液
(1) LB (Luria-Bertani) 培养基 (g/L) :蛋白胨 10, 酵母粉 5, NaCl 10 。
(2) 发酵培养基 (g/L) :蔗糖10, 蛋白胨 25, 酵母粉 5, NaCl 10, MgSO40.6, PLP 0.05,
KH2PO41.36 。
(3) 补料培养基 (g/L) :蛋白胨 125, 酵母粉 20, 蔗糖300, (NH4) 2SO45, NaCl 50, PLP 0.5, K2PO43,
MgSO46 。
(4) 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液:6.05 g Tris 溶解于超纯水中, 用HCl 调pH 至8.0 后用超纯水定容
至1 000 m L 。
1.2 方法
1.2.1 一级种子液培养方法
平板划线:将-80℃保藏的重组 E.coli BL21 (DE3) /pET-28b-Fn-TPL 在LB 固体培养基上划线活
化、分离, 于37℃恒温培养箱培养 14 h 。
摇瓶培养:挑取平板上的单菌落接种到 250 m L 摇瓶, 培养基为 50 m L LB 培养基, 并加入100μL
的卡那霉素(50 g/L) , 37℃、150 r/min 过夜培养约10h, 作为种子液备用。
1.2.2 二级种子液培养方法
取上述种子液按 2%接种量接种于 100 m L LB 培养基中, 37℃、150 r/min 培养 2 h, 加入IPTG 诱
导后于28℃条件下培养 10 h 。
1.2.3 发酵罐培养
5 L 发酵培养: 先将发酵罐进行空消 (121℃, 20min) , 待发酵罐罐体冷却配制3 L 发酵培养基, 再
进行实消灭菌(121℃, 20 min) 。灭菌完成后按照说明安装好p H 电极、溶氧电极、温度电极和
搅拌转子等附件, 连接好冷凝水管路及通气设备, 冷却至 37℃。接种100 m L 二级摇瓶种子液,
搅拌转速 450r/min, 通气量0.45 m3/h (通气比约为1.5 vvm) , 罐压0.05 MPa, pH 控制为 6.5, 用
40%氨水和50%磷酸调节p H。按1.5%的接种量将摇瓶培养的种子液接种到 5 L 发酵罐中 (转接
的过程中, 在进样口套上火圈, 火圈内加入用酒精浸湿的酒精棉, 点燃, 打开进样口, 倒入摇瓶中
的种子液, 旋紧进样口, 熄灭火圈) , 37℃培养 3 h, 溶氧降为0%, 降低温度至30℃, 加入乳糖 (终
浓度20 g/L) 诱导, 流加 40%氨水和50%磷酸调节p H 为6.5, 待溶氧值上升至 100%后稳定1 h 停
止发酵, 离心收集菌体。
摘要：
展开>>
收起<<
重组E.coli发酵产酪氨酸酚裂解酶的最优条件 摘要：左旋多巴是治疗帕金森氏病的首选药物,生物酶法合成左旋多巴具有工艺简单、条件温和、立体选择性高和环境友好等优点。本论文以实验室前期构建的表达具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)TPL(Fn-TPL)的重组大肠杆菌为基础,采用单因素实验通过对5L发酵罐发酵工艺优化以及补料策略的研究,确定了分批发酵的工艺参数:pH6.5,诱导温度30℃,诱导剂乳糖20g/L。在5L发酵罐中,进一步研究了10mL/h、20mL/h、30mL/h三个速率的恒速流加对菌体生物量和TPL酶活的影响。结果表明,补料速率为20mL/h时,生物量最高为3...
相关推荐
-
福特锐界汽车营销策略
2022-10-15 114 -
车联网面临的安全风险与应对措施
2023-02-25 144 -
保险营销的现存问题与策略创新
2023-02-25 72 -
保险经纪人作为保险营销主要力量的探析
2023-02-25 77 -
我国家政服务质量的问题及提升对策
2023-05-24 133 -
微波通信的优点及其在移动通信网络中的具体应用
2023-05-24 295 -
网络信息安全中密码学的运用及其安全性分析
2023-05-24 118 -
探讨卫星通信组网在人防中的应用
2023-05-24 103 -
探讨傣族服饰文化融入幼儿园美术教育的有效路径
2023-05-24 73 -
我国中小企业电子商务管理现状分析
2024-03-02 33
作者：闻远设计
分类：其它行业资料
价格：免费
属性：5 页
大小：18.57KB
格式：DOCX
时间：2024-04-02
