转氨酶在手性化合物合成中涉及项目的现状综述
转氨酶在手性化合物合成中涉及项目的现状综
述
近年来，手性制药工业迅速发展壮大，单一对应体药物每年以大于 20% 的速度增长，其对手
性胺的需求也随之增长。目前，超过 70% 的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心
血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体，抗糖尿病新
药Janu-via 的主要成分西他列汀是 Ｒ-型胺。这就催促人们寻找一种高效制备手性胺的方法，
而转氨酶的出现使研究者看到了曙光。转氨酶以其高选择性、高转化率及温和的反应条件赢得
了广大研究者的青睐，其能够催化 1 个氨基供体( 氨基酸或简单的胺) 上的氨基转移到前手性的
受体酮，得到手性胺和副产物酮或者 α － 酮酸( 图1) ，反应过程需要磷酸吡哆醛 ( pyridoxal
phosphate，PLP) 的参与。
转氨酶合成手性化合物已经发展为一项关键的不对称合成技术，受到越来越受到众多研究者的
重视和关注。2013 年2 月28 日，第一届国际转氨酶生物催化研讨会于瑞典斯德哥尔摩召开，
鉴于此，本文作者将转氨酶在手性化合物合成中涉及到的蛋白工程、表达与固定化、进程工程
及应用方面的研究现状予以综述。
1 转氨酶蛋白工程
蛋白工程是指通过改变已知蛋白的结构来改变其性质的过程，需要借助计算机和生物信息学手
段来实现，是研究酶的功能及进化的重要技术，也是改变酶性质、开发新酶的重要方法。利用
蛋白工程的方法对转氨酶进行改造即为转氨酶蛋白工程，其目的是得到有工业应用价值的酶，
打通手性药物及化工产品的酶法合成途径。所用关键技术包括理性设计、定向进化以及两者组
合方法; 所涉及工具主要包括迭代饱和诱变( it-erative saturation mutagenesis，ISM ) 、组合活性
位点饱和测试( combination of active site saturationtest，CASTing ) 、蛋白序列活性关系 ( protein
se-quence activity relationship，ProSA Ｒ) 等。随着计算机技术以及生物信息学的快速发展，转
氨酶蛋白工程迎来了第三次浪潮，成为国内外研究热点。
转氨酶蛋白工程主要包括 5 个步骤: 选择合适的模板、稳定模板、确定活性位点、活性位点周
围氨基酸残基理性设计或定向进化、突变体活性评估。经过以上几步，就可以根据人们的意愿
将一个原本对某一底物无活性的转氨酶变为对此底物活性很高的生物催化剂，在此方面最成功
的例子当属 Savile 等利用蛋白工程手段得到的突变型 ATA-117，其能够用于工业化生产西他列
汀。到目前为止，此酶是转氨酶工业化应用最成功的例子，利用该酶的西他列汀生物催化合成
工艺获得2010 年美国总统绿色化学挑战奖。目前，国内外很多课题组都在进行转氨酶蛋白工
程的研究，近五年来，新型转氨酶如雨后春笋般涌出( 表1) 。
2 转氨酶表达与固定化
转氨酶的表达目前有 3 种途径。第一，利用原始菌株表达，由于原始菌株表达量低及效率低下
等不足，此途径现一般只在新产酶菌株初步筛选阶段使用; 第二，利用工程菌表达，此法应用
最多，目前转氨酶已经在原核与真核系统中实现表达。原核表达普遍采用大肠杆菌表达系统，
例如Iwasaki 等成功构建一种 Ｒ-型转氨酶( Ｒ-TA) 的表达工程菌E ．coli HB101-pAT28-Ｒ-
TA ，通过工程菌的诱导表达可以得到大量Ｒ-TA; Savile 等构建工程菌E. coli W3110-
pCK110700-ATA-117 表达 ATA-117 及突变酶; Cassimjee 等利用工程菌E ．coli BL21 ( DE)-
pET28-ATA-113 成功实现转氨酶 ATA-113 的大量表达。原核表达系统是目前掌握最为成熟的
表达系统，其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而所需的成本相对低廉。但原核
表达系统还存在许多难以克服的缺点，如无法对表达时间及表达水平进行调控，目的蛋白易形
成包涵体，导致产物纯化困难。为弥补以上不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因
调控领域，采用真核系统进行目标蛋白的表达。真核表达有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统
和哺乳动物细胞三种系统，目前，转氨酶多采用毕赤酵母表达系统，如 Bea 等成功构建了ω-
TA 的真核表达系统P. pastoris GS115-pPIC-ω-TA; Weinhandl 等通过转氨酶基因密码子优化，构
建了能够大量表达 ilvE 的P. pastoris Mut-SpPpT4_S / pPpT4 _GAP_S-ilvE。真核表达系统能诱
导基因高效表达，可达原始表达量的105 倍，另外，其还能严格调控基因表达，是原核表达系
统所不能及的，因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视，其多用于可调控的
转氨酶的大量表达。第三，通过无细胞体系表达。Kwon 等建立了一种无细胞蛋白合成系统成
功实现了 ω-TA 的非克隆性表达，此方法主要使用于转氨酶的高通量筛选。
在转化中作者通常用到 2 种酶形式: 游离酶和固定化酶。游离酶活性虽高但是只能用 1 次，且
会影响产物的分离纯化，而固定化酶则会大大提高重复利用率，因此成为了研究重点。转氨酶
的固定化包括固定化细胞和固定化游离酶。固定化细胞所用材料主要是壳聚糖、海藻酸钠以及
一种新型材料 LentiKats。Ｒ ehn 等发现利用壳聚糖固定化含有ω-TA 的大肠杆菌细胞，在优化
条件下，细胞加载量可达3. 2 g·g －1 壳聚糖，残留活性大于 60% ，在 1 h 的反应中，连续 8 次
反应，固定化酶活性仍大于 90%。Fernandez 等利用 LentiKats 固定化含有ω-TA 的大肠杆菌细
胞，其稳定性得到了提高，在连续五次合成 1-苯乙胺及 3-氨基- 丁苯后，残留活性仍大于 80%
。固定化游离酶所用材料主要有聚合树脂、溶胶/硅藻土基质、壳聚糖、硅胶。Truppo 等利用
一种聚合树脂 SEPABEAD EXE120 成功固定化西他列汀转氨酶( 突变型 ATA-117) ，固定化酶
以异丙醇为溶剂，在 200 g·L －1 底物浓度下，重复使用 10 次，连续反应 200 h，其活性并无
损失。Mallin 等利用优化的壳聚糖固定化两个 Ｒ-TA ，两个固定化酶对于 1-苯乙胺的合成都有
很好的活性，其中一种转氨酶转化在合成 Ｒ-2- 己胺时，活性比游离酶提高了 13. 4 倍，转化率
大于 99%。此外，Matosevic 等利用固定化酶微反应器平台成功实现了手性氨基醇多步生物转
化筛选过程。由以上例子可以看出，转氨酶的固定化在提高酶稳定性、拓宽酶使用范围以及改
善酶反应条件方面都有重要意义，通过固定化，有望克服游离酶反应的过程瓶颈，实现转氨酶
工业化应用。但是固定化酶由于传质限制，酶活性会普遍降低，同时固定化酶的制备增加了酶
的成本，因此更加优越的固定化介质有待开发。
3 转氨酶过程工程
转氨酶催化的转氨反应是一个热力学平衡过程，主要包括两个互补的反应: 手性胺的不对称合
成和外消旋胺的运力学拆分。以上两个反应过程受反应物、产物、反应条件等因素影响，反应
时所发生的平衡逆向移动是转氨反应中的瓶颈问题。因此，要实现高效率不对称合成就需要从
影响因素入手，改变反应的平衡。众多学者就此问题进行了深入的研究，现将解决方案归纳如
下:
3. 1 加入过量的氨基供体
改变平衡的一个最简单的方法就是加入过量的氨基供体，Savile 等在生产西他列汀时就采用了
此方法: 在优化的反应条件下，向 40 mL 反应体系中加入 2 －丙胺39. 8 mmol，前西他列汀酮
18. 9 mmol，此时氨基供体的量是氨基受体的 2 倍; 在放大的反应体系中，加入高达 10 倍过量
氨基供体，反应得到西他列汀的转化率为 92% 。
需要注意的是此种方法只适用于反应的平衡对产物产率影响不大的情况。如果平衡严重不利于
产物的生成，而反应所需的底物质量浓度比较高( ＞50 g·L －1) ，氨基供体和受体按照 1 ～
50 1∶的摩尔比进行反应，氨基供体的过量倍数将会受到限制，加入太多的氨基供体将会出现
可溶性差等其他的问题。
3. 2 副产物的自动降解
副产物自动降解是利用副产物在反应条件下自动形成另外一种非反应成分，达到解决抑制的目
的。Lo 等发现以鸟氨酸和赖氨酸作为氨基供体时，反应产生的氨基酮会自动环化，使平衡向
生成胺的方向移动。同样 Truppo 等在利用转氨酶合成 6-甲基-2-吡咯酮( 50 g·L －1) 的反应中(
图2) ，利用一级产物乙胺基丁酰乙酯的自动环化，形成非抑制性终产物 6-甲基-2-吡咯酮的反
应趋势，解除一级产物抑制，获得终产物时转化率大于 90% ，产物 ee 值大于 99%。副产物自
动降解是一种非常传统的方法，受到副产物性质限制，其应用并不多。
3. 3 移除产物或副产物
由于产物或副产物的存在，常常会对平衡产生抑制作用，因此可以通过在反应时移除产物或者
副产物的方法来改变平衡，这种方法也称为在位产物移除( in situ product removal，ISP Ｒ)
，ISP Ｒ的效率与产物胺以及其它反应组分的性质有关。
其中产物的物理化学性质如挥发性、溶解性、带电性、疏水性、和分子大小是IS ＲP 中研究
最多的几个方面。
实现 ISP Ｒ 的途径有多种。Koszeiewski 等在利用 ATA-117 转化 4-苯基-2- 丁酮合成 Ｒ-4-苯基
丁-2-胺的过程中，综合运用有机溶剂萃取和调整 pH 的方法使反应物的转化率达到 92% ，ee
值高达 99%; Truppo 等在利用 ATA-113 和ATA-117 转化苯乙酮合成 α-甲基苯乙胺的过程中采
用树脂提取技术成功获得了高达 99% 的转化率，与之前不采用ISP Ｒ 技术的转化率 10% 相
比，反应的转化率得到了大幅度的提高。另外让易挥发的副产物挥发掉也可以作为改变平衡的
一个方法。
当以2- 丙胺或者 2-丁胺作为氨基供体时，会产生副产物丙酮或者丁酮，由于丙酮和丁酮与其它
反应物相比具有较低的沸点，因此可以通过减压使副产物挥发掉，这样转氨反应就趋于完全。
此外对于易挥发的胺还可以通过蒸馏的方法进行产物回收，这种方法多用于动力学拆分。
3. 4 酶偶联反应
摘要：
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转氨酶在手性化合物合成中涉及项目的现状综述近年来，手性制药工业迅速发展壮大，单一对应体药物每年以大于20%的速度增长，其对手性胺的需求也随之增长。目前，超过70%的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体，抗糖尿病新药Janu-via的主要成分西他列汀是Ｒ-型胺。这就催促人们寻找一种高效制备手性胺的方法，而转氨酶的出现使研究者看到了曙光。转氨酶以其高选择性、高转化率及温和的反应条件赢得了广大研究者的青睐，其能够催化1个氨基供体(氨基酸或简单的胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮或者α－酮酸(图1)，反应过...
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作者：闻远设计
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