对研究山银花黄芩材料与方法,党参、生地、茯苓、防风、蝉蜕、黄芩、丹参、赤芍、金银花、...

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对研究山银花黄芩材料与方法

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对研究山银花黄芩材料与方法范文

本文的目录导航:

[标题]黄芩提取物对肉鸡生长的影响

[第1章]黄芩化学成分和药理作用研究简介

[第2章]黄芩材料和方法研究结果

[第3章]提取物对肉鸡生长的影响

[第4章]植物提取物对黄芩和黄芩提取物应用的影响

[第5章-参考文献]

2材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验药品

山银花黄芩提取物，由爱迪森（北京）生物科技有限公司提供，批号：1302261.含量：每 1g 山

银花提取物以绿原酸（C16H18O9）计，含量为 2.40mg;每1g 含黄芩提取物以黄芩苷

（C21H18O11）计，含量为 24.0mg.

阿司匹林泡腾片：购自阿斯利康制药有限公司，批号：1209021.规格：0.5g/片。

二甲苯，购自北京化工厂，纯度>99%,批号：20121203.

博落回散（主要是血根碱、白屈菜红碱），购自湖南美可达生物资源有限公司，产品批准文

号：兽药字（2012）180415250.批号：20130205.

10%氧氟沙星溶液，购自北京普尔路威达兽药有限公司，批号：1310041J.

10%氧氟沙星可溶性粉：由爱迪森（北京）生物科技有限公司提供，批号：121121.

2.1.2 实验动物及饲养管理

4~6 周龄清洁级昆明种小白鼠（体重 20±2g）210 只，SD 大鼠（体重 200±20g）30 只，购自北

京维通利华实验动物技术有限公司，雌雄各半，饲养条件：室温（22~25℃），相对湿度为

65%±5%,12h 明暗交替照明，自由进食、饮水。

1日龄爱拔益加（AA+）肉仔鸡公雏 420 只，购于北京昌平爱拔益加孵化场。试验鸡均饲养于

标准鸡舍，自由采食、饮水，饲养密度控制为 15 只/m2,按照常规方法饲养管理，试验期间执行

严格的防疫消毒措施。

7日龄，接种新-支二联活疫苗；14 日龄，接种法氏囊疫苗。

2.1.3 菌株、试剂和培养基金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株由北京生泰尔科技股份有限公司研究

院提供。

血液脂质代谢指标、血液抗氧化指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，严格按照

说明书进行操作。

血清免疫球蛋白，采用购自哈尔滨赛莱博公司试剂盒测定。

营养肉汤，普通肉汤琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。

2.1.4 主要实验仪器与设备

生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X,青岛海尔生物医疗设备公司

超净工作台：Theme Scientific 1829.SN.

17069-15CO2 恒温培养箱：3000T 型，美国REVCO 公司

PH 计：sartorius PB-10,赛多利斯科学仪器有限公司

移液器：Thermo Fisher 公司

电子天平：FA1004N,上海精密仪器仪表有限公司

低温台式高速离心机：Beckman Avanti TM 30 中国贝克曼库尔特商贸有限公司

进口电热恒温培养箱：DNP-9162 型，上海精宏实验设备有限公司

电热恒温水槽：DK-80 型，上海精宏实验设备有限公司

显微镜：OLYMPUS LMT-2 型由日本OLYMPUS 公司

生产微孔滤膜：0.22?m,南京禾汽化玻仪器有限公司

2.2 试验方法

2.2.1 山银花黄芩提取物的抗炎抑菌作用试验

2.2.1.1 山银花黄芩提取物抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验

分别称取山银花黄芩提取物，以去离子水溶解制得浓度为 256mg/m L、128mg/m L、64mg/m L

的山银花黄芩提取物溶液。同法制得浓度为 12 mg/m L 的阿司匹林溶液，4℃备用。

将50 只清洁级昆明种小白鼠置于室温（22~25℃），相对湿度为 65%±5%,12h 明暗交替照明，

自由进食、自由饮水的条件下饲养。随机分为 5组，每组10 只，雌雄各半，分别为模型对照

组、阳性药物组和山银花黄芩提取物高、中、低剂量组。模型对照组不给药，阳性药物组和山

银花黄芩提取物低、中、高剂量组每天分别用阿司匹林溶液和山银花黄芩提取物低、中、高浓

度的溶液对小鼠灌胃，剂量为 0.5m L/20g,对照组灌胃同等体积的饮用水。连续给药7d.末次给

药40min 后，各组小鼠右耳内外涂以二甲苯 20?l 致炎，左耳作为对照，1h 后将所有小鼠脱颈处

死，沿耳廓根部剪下两耳，用打孔器（直径 6mm）取下相同位置耳片，称重，以左右耳片的重

量之差作为肿胀度，算出肿胀率（%）。

肿胀率（%）=（右耳重-左耳重）/左耳重×100%2.2.1.2 山银花黄芩提取物体外抑菌试验（1）

供试菌和山银花黄芩提取物供试品溶液的制备将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种到营养琼脂平

板上划线接种，37℃培养，待细菌达到对数期时将典型的单个菌落接种在营养琼脂培养基斜面

上传代，传至 3代后的菌种即可作为供试菌种。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液分别进

行活菌计数，用营养肉汤稀释成含菌约105~106 个/m L 的菌液，制为供试菌液。

精确称取山银花黄芩提取物 5g,加去离子水溶解（以氢氧化钠溶液调p H 值至 7.0），溶解后过

滤，滤液置于50ml 容量瓶中，用去离子水定容，3000r/min 离心 5min 取上清液，用 0.22?m 的

滤器过滤除菌，得到的山银花黄芩提取物溶液浓度为 100mg/m L,4℃备用。

（2）山银花黄芩提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑制作用取 24 支试管，分两组，

每组12 支试管，编号依次为1~12,按无菌操作法在2~12 号试管中分别用移液管加入2m L 营养

肉汤培养基，再用移液管吸取山银花黄芩提取物溶液（100mg/m L）2m L 放入每组的第 1管和

第2管，反复摇匀；从两组的2号管吸取2m L 放入第3 ……号管，依次倍比稀释至 9管，吸出

2m L 弃去，药物浓度则依次为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39mg/m L.第10

号管中加入氧氟沙星溶液，使其作为阳性对照，最终浓度为 1.6?g/m L,第11 号管作为阴性对

照，第 12 号管作为空白对照，然后将 0.1m L 供试菌液分别加入两组试管的第 1~11 号管。置各

试管于 37℃培养箱中培养 24h,观察细菌生长情况。如试管为浑浊，表示细菌已生长，该管浓度

的药物无抑菌作用；如试管澄清，表示细菌生长受到抑制，则该管药物有抑菌作用，能抑制细

菌生长的最低药物浓度作为山银花黄芩提取物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory

concentration,MIC）。

2.2.1.3 山银花黄芩提取物体内抗感染试验

（1）山银花黄芩提取物溶液及菌液的制备分别划线培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌株，

挑选典型菌落接种普通肉汤琼脂培养基，37℃培养 18~24h,连续传代 3次，取菌落用普通肉汤

培养基制成大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液。同时制得浓度为 256mg/m L、128mg/m

L、64mg/m L 的山银花黄芩提取物溶液和 32mg/m L 的氧氟沙星可溶性粉溶液。

（2）体内抗感染预试验按无菌方法操作，将制备好的菌液用麦氏计数法分别制成

1013、1012、1011、1010、109、108、l07、106cfu/m L 的不同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌

菌液。将不同浓度的菌悬液分别腹腔注射体重 20±2g 的小鼠，每个浓度组5只小鼠，每只 0.5m

L/20g,记录 7d 内小鼠的死亡情况，分别找出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液的最小致死量

（minimum lethal dose,MLD），即感染后引起小鼠 100%死亡的菌液浓度。

（3）体内抗感染试验将小鼠分 5组，即山银花黄芩提取物低浓度组（64mg/m L）、中浓度组

（128mg/m L）、高浓度组（256mg/m L）、氧氟沙星组（32mg/m L）、空白对照组。每天用

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