大肠杆菌中抗菌肽的融合表达

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大肠杆菌中抗菌肽的融合表达

　　摘　　　　要：抗菌肽抗菌谱广、活性稳定, 具有与抗生素不同的抗菌机制, 在抑杀病原微生物

的同时不易产生耐药性, 在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力, 能够发展为取代抗生素

的新型药剂, 在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗

菌肽生产成本的主要方式, 其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌

肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展, 探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略, 并对

高通量融合表达抗菌肽提出了建议。

　　 Abstract： Antimicrobial peptides have a wide antimicrobial spectrum and stable activity,

with different antibacterial mechanisms from antibiotics, they result in a higher efficacy against

pathogens. At the same time, they're difficult to form drug resistance. Antimicrobial peptides have

great development potential in immune regulation and anti-infection, so they're able to develop new

agents, to replace antibiotics. Besides, they have immense applied value in food, forage, poultry

breeding and so on. Genetic engineering is the main way to reduce the production costs in

antimicrobial peptides, furthermore, the fusion expression plays a important role in improving

production. In this paper, we summarized the research progress of antimicrobial peptides' fusion

expression in E. coli, at home and abroad. Also, the fusion strategy in E. coli are discussed, and we

proposed our own view on the high flux fusion expression of antimicrobial peptides.

　　 Keyword： antimicrobial peptides; Escherichia coli; genetic engineering; fusion expression;

high-throughput;

真菌、细菌对抗生素的耐药性引起了全世界范围的普遍担忧, 导致巨大的财力、物力花费在寻

找新型抗生素上, 但效果甚微[1]。一些抗生素对普通的感染作用效果差, 引起大众对不可治愈的

恐慌[2]。现在大量的研究者从事于抗生素的耐药性机理的研究, 但是由于缺乏协调行动, 进展非

常缓慢[3]。目前的形势需要开发出抗生素的替代品。

抗菌肽是动物、植物等生物体免疫系统防御外来真菌、细菌等病原微生物入侵而合成的一类小

分子多肽类物质[4,5]。抗菌肽一般由 10~60 个氨基酸组成, 其中接近一半是亲水性氨基酸, 带有

一定量的正电荷, 能够直接攻击或破坏细菌、真菌的细胞膜或病毒的包膜。不同于抗生素作用

于酶或 DNA, 抗菌肽能够阻碍产生耐药性, 并且对热稳定, 一些抗菌肽 100℃加热 10 min 仍有活

性, 有较宽的 p H 耐受范围[6]。加热抗菌肽抗菌谱广, 活性稳定, 并且不会对人及其所生存的环

境产生危害, 绿色环保。基于这些优点, 激发了广大科研人员的兴趣, 科研人员已经对抗菌肽的

作用机制、安全性进行了深入研究, 并且提供了抗菌肽在线更新数据库(APD, http://aps.unmc

edu/AP/) 服务[6,7]。已经有 2 000 多种抗菌肽被分离出来[8], 其中, 部分已经用于医药、食品及

畜禽水产养殖等领域[9]。

尽管在抗菌肽的研究领域已经取得丰硕的成果, 但由于生产成本居高不下, 难以投入工业化生产

和商业化运营。大量高纯度的抗菌肽是开展基础研究及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资

源有限、纯化困难, 化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定, 因此通过基因重组来表达得到大量抗

菌肽是低成本、高效益的方法[10]。

　 1　、抗菌肽表达系统

　　 1.1 　、昆虫表达系统

广泛使用的真核表达系统, 赵昆等[11]实现牛抗菌肽 Bac7-Bac5-βdefense 串联基因在昆虫杆状病

毒系统中的表达。昆虫具有一般真核生物翻译后修饰的功能, 且表达水平高, 成本低, 但是翻译

后加工修饰操作繁琐。

　 1.2 　、毕赤酵母表达系统

另一个常用的真核表达系统为毕赤酵母。同昆虫一样具有完备的翻译后修饰的功能, 目前已经

实现了多种抗菌肽在其中的表达, 如孙立人等[12]试验斑点叉尾�tLEAP-2 抗菌肽在毕赤酵母中

的表达, 随着发酵时间的延长, 表达产量在上升, 当发酵培养120 h 后产量达到 2.7 mg/L (最高值)

。Farzana 等[13]利用p PIC9K 表达载体实现了人类抗菌肽 hpcidin 在毕赤酵母中的分泌表达及

纯化和功能验证, 并且表达量稳定在 3 mg/L。毕赤酵母中存在表达水平低, 发酵周期长, 易污染

等问题[14]。

　 1.3 　、大肠杆菌表达系统

大肠杆菌遗传图谱清楚, 易培养, 周期短, 对许多蛋白质都有一定的耐受能力, 在较短的时间内可

以高水平地表达多种蛋白, 发酵条件易掌控, 但是缺乏像酵母等真核系统翻译后修饰加工功能,

所表达的产物生物活性较低[15]。然而抗菌肽都是一些小肽类分子, 不需要翻译后修饰等过程,

因此大肠杆菌是抗菌肽首选的表达系统。

　 2 　、抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

抗菌肽分子小, 直接表达不仅对宿主具有毒杀作用, 而且极易被一些蛋白酶水解, 因此难以获得

具有天然活性的抗菌肽。为了解决这个问题, 目前普遍采用的是在抗菌肽的 N端接入一个可以

在大肠杆菌中表达的蛋白质, 进行融合表达, 然后通过化学试剂处理或添加酶处理除去载体蛋白,

进一步分离提纯, 就可以获得高产的抗菌肽[16]。

　 2.1　、融合蛋白标签

载体蛋白的功能是避免抗菌肽被蛋白酶降解和对宿主产生毒杀作用, 现在抗菌肽在大肠杆菌的

融合表达的主要载体蛋白可以分为四大类:增强可溶性的融合标签, 促进包涵体形成的融合标签,

可自我剪切的融合标签, 信号肽类的融合标签[17]。本文综述了一些常用的融合标签及其表达策

略。

2.1.1 　、增强可溶性的融合标签

1) 谷胱甘肽转移酶(GST) 融合标签。GST 可以在大肠杆菌融合表达中稳定存在, 可以迅速通过

固定了谷胱甘肽的色谱柱从溶菌后的混合液中分离, 非变性的条件下 10 mmol/L 的还原型谷胱

甘肽洗脱获得 GST—抗菌肽融合蛋白[18]。融合蛋白通过位点专一的蛋白酶如凝血酶或 Xa-因

子切除 GST 部分, 获得目的蛋白。欧阳萍等[19]将人溶菌酶和抗菌肽 tachyplesins 融合基因克隆

至带有 GST 标签的原核表达载体p GEX-4T-1 上, 转化大肠杆菌 BL21 (DE3) , IPTG 诱导表达, 并

对表达条件进行优化, 纯化融合蛋白纯度达90%。由于 GST 标签有助于保护重组蛋白免受胞外

蛋白酶的降解, 提高其稳定性、可溶性, 并且通过亲和层析简化后续的纯化工作, 所以抗菌肽同

GST 标签融合表达将显着提高其表达量、降低生产成本。但是由于 GST 融合标签过大(27KD) ,

而抗菌肽分子小, 二者相比质量差距大, GST 会影响抗菌肽的表达产量[20]。

2) 硫氧还蛋白 (thioredoxin) 融合标签。硫氧还蛋白是比GST 更常用的融合表达标签, 分子量为

17KD, 不仅可以避免重组蛋白被蛋白酶降解, 还可以促进重组蛋白内二硫键的形成, 加工成更高

稳定的结构[21]。硫氧还蛋白没有专门的亲和介质可以用于分离提纯, 因此在抗菌肽融合表达

时, 需要与一些亲和标签进行联合。Alem 等[22]利用硫氧还蛋白融合标签和His 亲和标签在大

肠杆菌系统中成功融合表达并分离得到了来自青苋中的 Aq 抗菌肽, 表达产量为 38

mg/L。Krahulec 等[23]成功融合表达了 Trx—LL—37 融合蛋白, 1 g 融合蛋白/每升培养液, 最终

高效液相色谱检测纯化的人源抗菌肽 LL37 的含量为 37 mg/L, 功能检测显示对革兰氏阳性菌和

革兰氏阴性菌都有很好的抑菌活性。Gagliardo 等[24] 在融合表达铁调素 (一种肝抗菌肽) 时验

证, 采用硫氧还蛋白作为融合蛋白标签时应该采用低温诱导的方式发酵, 这样能够协助抗菌肽的

可溶性表达。

3) 小分子泛素样修饰蛋白 (SUMO) 融合标签。SUMO 大约由100 个氨基酸组成, 类似于泛素但

功能完全不同, 是新发展起来的一类融合表达标签。SUMO 可以用于难以表达的蛋白质的融合

表达, 可抗蛋白酶水解, 引导目标蛋白的正确折叠, 增强融合蛋白的可溶性[25]。LI 等[26]成功融

合表达了 SUMO—CM4, NI 柱亲和层析获得每升 112 mg 的融合蛋白, 经SUMO 蛋白酶处理后,

可以获得 24 mg/L 的CM4, 功能检测同天然 CM4 抗菌肽一样具有良好的抑菌活性。由于 SUMO

蛋白酶用于分离提纯, 使得融合表达的成本升高, 限制了 SUMO 的应用, 姜媛媛等[27]设计了高

效可溶性表达重组蛋白的载体, 即His-SUMO 和目的序列之间加入羟胺切割位点在 His—SUMO

中表达的融合蛋白用Ni-NTA 纯化, 羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。

　 2.1.2　、促进包涵体形成的融合标签

蛋白质除了使用增强可溶性的蛋白标签实现高效表达, 后通过亲和纯化, 切除融合蛋白标签而获

得蛋白质, 也可以使目标蛋白质积聚在包涵体内进行表达。这种表达策略也应用到了抗菌肽领

域, 包涵体表达抗菌肽能够保护抗菌肽被蛋白酶降解。在这一类抗菌肽融合标签中主要有类固

醇异构酶、Purf 片段、Pa Per3.30、TAF12 组蛋白[28]。Kim 等[29]利用Pur F 片段实现了抗菌肽

histonin 包涵体形式的高表达, 在其表达系统内, 可以获得 167 mg/L 大肠杆菌发酵液。

为了获得抗菌肽单品, 需要收集包涵体, 可能会破碎细胞壁, 细胞内容物流出影响分离纯化, 需要

经历变性、复性等过程, 操作繁琐, 并且收率较低, 因此目前多使用可溶性表达, 较少考虑包涵体

形式表达。

　　 2.1.3　、可自行切割的融合标签

内含肽是前体未成熟的蛋白质中一条多肽链, 又称作内含子蛋白质, 可以通过内含肽的自我剪接

作用使得蛋白质结构发生重排, 也利用内含肽的这一作用开发出众多的亲和纯化系统, 较其他的

亲和纯化标签简单, 通过改变温度、p H 或加入如巯基乙醇类化学试剂即可体外自我剪接, 获得

除去融合蛋白标签的抗菌肽[30,31,32]。Coolbaugh 等[33] 利用几丁质结合结构域(CBD) 亲和标

签和基于弹性蛋白样多肽亲和标签 (ELP) 实现了 β半乳糖苷酶和超折叠绿色荧光蛋白的高通量

表达纯化。Xie 等[34]利用内含肽融合表达系统, 实现了 OG—2 的高产量表达, 是目前最好的高

产量内含肽融合表达系统。

2.1.4 　、信号肽类的融合标签

信号肽能够引导蛋白质正常折叠, 在分泌表达时常引入信号肽增强分泌表达, 表达后, 信号肽会

被切除, 原保留在蛋白质N端的甲硫氨酸也会切除, 这样的蛋白质不用因为具备免疫原性而需要

再切除。大肠杆菌中常用的信号肽有 Omp A、Pel B、Pho A、Hly A、cherry 等[35]。Lee 等[36]

用Omp A Ⅰ实现了扁口鱼铁调素的可溶性表达。这一类融合标签目前用的很少。

　　 2.2 　、亲和纯化标签

上述提到的 GST、内含肽等融合蛋白标签自身可以作为亲和介质作用的亲和标签。另一个重要

的标签是聚组氨酸标签。组氨酸标签是大肠杆菌表达重组蛋白纯化中最常使用的亲和纯化标签,

可以与装载有Ni 的亲和柱子结合[37]。组氨酸标签很小, 不移除不影响蛋白质的结构, 但是在一

些情况有可能会影响蛋白质的溶解性及其功能[38]。张亚妮等[39]实现人工合成抗菌肽 D2A21

基因的克隆和表达, 其中直接应用 His6 表达和纯化抗菌肽 D2A21。Yi 等[40 构建His6—SUMO

—A20L 融合表达体系, 成功表达了抗菌肽 A20L, 最高纯化后产量为 5.3 mg/L, 表达的抗菌肽

A20L 抗多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。组氨酸标签用于抗菌肽的分离纯化, 简单易行, 是

设计并构建抗菌肽表达系统的首要选择。

2.3 　、融合蛋白标签的切除

融合蛋白标签的存在可能会影响目标蛋白的结构和功能, 为了获得具有正确结构和良好生物活

性的目标蛋白质产物, 需要采取一定的方法除去标签, 排除标签对蛋白质的影响[41]。

目前在抗菌肽融合表达领域蛋白融合标签的切除有3种方法, 即化学法、酶法和内含肽的自我

剪接等。

　 2.3.1 　、化学法

化学法是利用一些氨基酸之间的肽键对某些化学试剂敏感而发生断裂从而去除融合蛋白标签的

一种方法。Pane 等[42]构建来自人凝血酶C端的一段小的 GKY20 抗菌肽和豹蛙酶系列大肠杆

菌融合表达, 探索了化学法切除融合蛋白的反应条件和效率, 成功构建了能够利用稀醋酸等稀酸

断裂 Asp—Cys 之间的肽键和溴化氰断裂与甲硫氨酸相连的肽键从而除去融合标签, 并且表现出

高达 95%的切割效率。

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摘要：

大肠杆菌中抗菌肽的融合表达　　摘　　　　要：抗菌肽抗菌谱广、活性稳定,具有与抗生素不同的抗菌机制,在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性,在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力,能够发展为取代抗生素的新型药剂,在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式,其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展,探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略,并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。　　Abstract：Antimicrobialpeptideshaveawideantimicrobialspectru...

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