Red ET同源重组技术主要内容与运用

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Red/ET 同源重组技术主要内容与运用

2001 年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。为了解

这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。然而，对于真核生物

基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内

含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百 Kb.

虽然现今有相应的载体，如 BAC（人工染色体）和 PAC（P1 人工染色体）能装载如此大量的

基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增

的难度比较大[1、2].

Red/ET 重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，

它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免

外界环境引起的不必要的突变。

1 传统同源重组

自然发生的同源重组是两个 DNA 分子之间进行片段交换，从而使序列重排。1956 年，在大肠

杆菌中，A John Clark 发现了两种与同源重组有关的酶，RacA 和RecBCD.在同源重组发生的时

候，RecA 结合 DNA 单链或双链，对双链 DNA 进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身

与被入侵 DNA 链配对。当配对成功后，RecA 蛋白脱落。或者在 RecBCD 的引导下，使目标

DNA 解旋，以便使外源 DNA 分子插入并在 RecA 的帮助下进行重组。当两条链发生重组时，

会产生 holliday 中间体，该中间体在重组完成时由 RuvAB 和RecG 蛋白进行拆分。至此，形成

两条含有异源序列的双链 DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于 75bp

时会使重组率显着降低。但是实际上，在 RecA 重组系统中，要求同源臂的长度在 1kb 左右，

且反应条件要求比较苛刻。

2 Red/ET 同源重组技术

Red/ET 同源重组系统，其实是 Red 同源重组系统和 ET 同源重组系统的总称，其中 ET 系统于

1998 年由 Stewart 等在大肠杆菌中诱导的 Rac 噬菌体中发现，随后又在 λ噬菌体中发现了 Red

系统。在这两个系统中，整个重组过程由 DNA 重组酶参与而不需要限制性内切酶，且对同源

臂长度的要求低，仅需 35-50bp 的同源序列，而传统的 RecA 同源重组则需要大约 1kb 的同源

序列。并且该系统介导的整个同源重组过程都是在细内进行，避免了因胞外反应引起的不必要

突变。

2.1 ET 同源重组系统

该系统于 1998 年由 Stewart 等在大肠杆菌中诱导的 Rac 噬菌体中发现，其所需的单侧同源臂长

度仅为 35-50 bp,该噬菌体通过表达蛋白 RecE 和RecT 来介导重组反应。其中 RecE 蛋白有 5′-3′

外切酶活性，能够从5′-3′端依次切下双链 DNA 上的碱基，使 DNA 分子形成 3′粘性末端。RecT

是一种单链结合蛋白，保护单链核苷酸不被降解，能在退火时指导单链入侵。在 ET 系统中，

带有同源臂的外援DNA 分子可以直接通过同源臂找到同源区域，然后进行 DNA 的互换。

2.2 Red 同源重组系统

Red 重组系统也是由 Stewart 的实验小组在 λ噬菌体中发现，它是由 Redα 和Redβ 两种蛋白组成

的同源重组系统。Redα 由三个蛋白质亚基组成，中间的空隙能消化 DNA 分子，与 ET 系统中

的RecE 蛋白相似，它具有 5′-3′端核酸外切酶活性，能形成 3′粘性末端。

Redβ 也是一种单链结合蛋白，作用相似于ET 系统中的 RecT 蛋白。

3 重组原理及操作

3.1 Red/ET 同源重组的原理

根据 Red/ET 中Redα 及RecE、Redβ 及RecT 的功能，推测了该同源重组系统的作用机理。当

带有同源臂的外源 DNA 分子进入到大肠杆菌中时，Redα 或RecE 发挥其5′-3′端核酸外切酶功

能，由 5′端开始降解 DNA 序列，产生的 3′粘性末端，这时外源 DNA 具备了与受体 DNA 发生

重组的条件。产生的粘性末端被RecT 或者 Redβ 结合 35bp 的单链核苷酸序列，同时防止被细

胞内存在的核酸内切酶降解[i].在DNA 退火时，含有粘性末端的3′单链进攻双链 DNA 片段，重

组。发生重组的两条 DNA 链经过剪切和 DNA 聚合酶的修复作用后，重组 DNA 形成，外源

DNA 成功导入受体 DNA 中[3].

3.2 操作方式

该重组技术在的操作方式主要有两种。（1）建立含有将γ基因的 ET 系统或 Red 系统的质粒，

在实施重组时将三者共同导入受体分子中，共同表达。（2）直接在受体菌中筛选出能进行

Red/ET 重组的菌株。前者的重组成功率更高，但是当受体分子不容易接受外源 DNA 时，后一

种方式就显得更加便捷。

4 系统优化

最初 Red/RT 系统采用的是 pDAB-ETγ 依托型质粒载体，在该载体中，recE、recT 以及γ基因

分放在PBAD、EM7 和Tn-5 启动子下共表达。在之后构建的pDAB-ETg 和pDAB-gba 载体

中，RecE/RecT/Redγ 和Redα/Redβ/Redγ 被放在PBAD 启动子后面共表达，该启动子受 L-阿拉

伯糖诱导调控。但是在实际应用过程中却发现了一些问题。

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摘要：

Red/ET同源重组技术主要内容与运用2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源...

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