Rab29调控细胞内甲状旁腺激素受体转运的机制

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Rab29 调控细胞内甲状旁腺激素受体转运的机

制

摘要：目的研究 Rab29 在细胞内的分布以及对甲状旁腺激素受体（PTHR）胞内转运的调控作

用。方法采用免疫荧光技术观察 Rab29 在细胞内的分布；细胞内分别转染野生型 Rab29 和

Rab29 两种突变型，免疫荧光技术观察 3种Rab29 在细胞内的分布；细胞内共转染 PTHR 和

Rab29,免疫荧光技术处理后，在电镜下观察 Rab29 调控 PTHR 的胞内分布；半衰期实验检测细

胞Rab29 基因敲减后 PTHR 的稳定性。结果 Rab29 定位于反式高尔基体，Rab29 突变型的细胞

内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状，Rab29 的缺陷导致了 PTHR 的逆膜转运受损

和稳定性下降。结论定位于反式高尔基体的 Rab29 是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对

PTHR 的胞内转运起着重要的调控作用。

Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the

Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By

immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type

Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of

the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR

and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was

regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been

observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-

down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear

pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of

PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is

indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.

Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.

甲状旁腺激素受体（PTHR）参与机体骨与钙代谢，在骨质疏松的发生发展中起着重要的作用

[1-3].PTHR 的胞内转运机制是目前研究的热点[4].Rab29 是一种小 G蛋白酶，是 70 多个 Rab 蛋

白家族的一员，已经被证实在囊泡出芽、融合以及保持包膜细胞器的完整性中发挥重要作用[5-

7].本研究通过观察 Rab29 在细胞内的定位，细胞转入 Rab29 突变型观察 PTHR 在细胞内的分布

以及基因敲除 Rab29 观察 PTHR 的稳定性，从而探讨 Rab29 对甲状旁腺激素受体胞内转运的调

控作用。

　 1 材料与方法。

1.1 材料来源。

人Rab29、PTHRcDNA 序列由 Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美国）公司提供；Myc-6 磷酸

甘露糖受体（MPR）的质粒由 Nebraska 大学的 Richard G.MacDonald 教授赠与；pcDNA3.1-

3Flag 和pcDNA3.1-3HA 空载体由本实验室提供；10%胎牛血清由 Hyclone（美国）公司提供；

Hek293 和Hela 细胞由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供；脂质体 Lipofectamine2000 由

Invitrogen（美国）提供；电化学发光（ECL）试剂由 Sigma （美国）提供。

1.2 方法。

1.2.1 细胞培养与转染用 10%胎牛血清完全培养基，在 37℃，5% CO2 的培养箱中培养 Hek293

和Hela 细胞。常规 PCR 突变技术获得 Rab29-T21N 和Rab29-Q67L 突变，将 Rab29 的编码区插

入pcDNA3.1-3Flag 和pcDNA3.1-3HA 空载体中的 KpnⅠ/Xbal 区，以获得 3xFlag/3xHA-Rab29,

将PTHR 的编码区插入 pcDNA3.1-3Flag 和pcDNA3.1-3HA 空载中的 HindⅢ/Xbal 区以获得

3xFlag/3xHA-PTHR.转染依照转染试剂说明书将受体质粒与 Lipofectamine2000（Invitro-gen,美

国）混合，在细胞融合度达到 70%~80% 时进行。

1.2.2 免疫荧光染色成像技术检测 Rab29 在细胞内的定位将 HEK293 细胞事先种于铺好 L-多聚

赖氨酸和基质胶的盖玻片上，分别用 Golgin97 抗体识别高尔基体，EEA1 抗体识别内体，Flag

抗体识别 3Flag-Rab29,在LSM 510 共聚焦显微镜（Zeiss, 德国）下进行免疫荧光测定。用蛋白

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摘要：

Rab29调控细胞内甲状旁腺激素受体转运的机制摘要：目的研究Rab29在细胞内的分布以及对甲状旁腺激素受体（PTHR）胞内转运的调控作用。方法采用免疫荧光技术观察Rab29在细胞内的分布；细胞内分别转染野生型Rab29和Rab29两种突变型，免疫荧光技术观察3种Rab29在细胞内的分布；细胞内共转染PTHR和Rab29,免疫荧光技术处理后，在电镜下观察Rab29调控PTHR的胞内分布；半衰期实验检测细胞Rab29基因敲减后PTHR的稳定性。结果Rab29定位于反式高尔基体，Rab29突变型的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状，Rab29的缺陷导致了PTHR的逆膜转运受损和稳定性下降...

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