CRISPR Cas作用机制及最新研究成果

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CRISPR/Cas 作用机制及最新研究成果

基因组编辑是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主

要是进行 DNA 序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的

系统研究[1].基因组编辑技术日益成为生物学研究的热点，目前基因组编辑技术主要包括巨核

酶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术及 CRISPR 相关核酸酶技术

[2].它们在基因工程中已经得到了诸多成功的应用，然而上述传统的基因组编辑技术存在明显

的不足。例如，锌指核酸梅（zinc-fingernucleases,ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸梅

（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）核酸酶技术原理几乎是一样的，而一个新

的ZFN 和TALEN 嵌合蛋白均需改造才能识别靶序列，这就使得两种基因组编辑技术的广泛推

广应用受阻，但 CRISPR 相关核酸酶技术只需要一小段引导 RNA（guideRNA、g RNA ）就能

识别特定的DNA[2], 且一个新的位点只需要一个新的 g RNA,极大的简化了基因组编辑的过

程，扩大靶位点的选择，具有更大的潜力。CRISPR 系统也可以应用于靶向基因突变和基因修

正，可以实现大片段 DNA 的缺失以及复合基因编辑。

本文将针对 CRISPR/Cas 系统的结构、分类、原理以及目前具有突破性研究并迅速发展的 Type

ⅡCRISPR/Cas 系统和 Type ⅢCRISPR/Cas 系统的突破性研究做较为详尽的综述。

　 1　　CRISPR/Cas 的基因座结构

CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单（图 1 ），对于一个有效的 CRISPR/Cas 系统而言，通常包

含两个部分 : 第一部分是位于基因组中正向重复序列和来源于外源 DNA 的间隔序列组成 3‘ 端

CRISPR 基因座，对于重复序列而言在长度和序列上几乎一致，在不同的物种之间长度范围在

21-47bp,平均在 32bp[3,4]; 间隔序列在长度上是一致的，长度范围在 20-72bp,但在序列上表现出

多样性[4,5].亲缘关系相近的物种具有相似的重复序列，但是在全部的细菌和古细菌序列中间隔

序列和重复序列都表现出极大的差异[6]. 第二部分是位于 CRISPR 基因座 5’ 端成簇的 Cas 基

因，主要包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和 RNA 结合蛋白等，主要参与 CRISPR/Cas 系统

介导的免疫过程[7].

2　　CRISPR 的分布与分类

目前对于 CRISPR/Cas 系统而言主要分为 3 种类型 :Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ 三种不同类型[8],

从另一方面也反映出在自然界中 CRISPR/Cas 系统具有多态性。

Type Ⅰ CRISPR/Cas 系统在细菌和古细菌中被发现，包含 6 种不同的 Cas 蛋白，其中在干涉反

应中最重要和最显着的是 Cas3 蛋白，它包含一个 HD 磷酸化水解酶结构域和一个类 DEx H 解

旋酶结构域，这两个结构域在 ATP 和Mg2+存在的情况下能够解开ds DNA（解旋酶结构域）

和切割 ss DNA（HD 核酸结构域）[9].

Type ⅡCRISPR/Cas 系统仅仅在细菌的基因组中发现[9], 其中 Cas9 是分子量很大的多功能

蛋白，参与 cr RNAs 的成熟和随后的干涉反应[10].Cas9 蛋白包含有两个亚基，在

Mg2+ 存在条件下，其中 Mcr A/HNH 切割与cr RNA 互补的DNA 链，而类 Ruv C 切割非互补

链[9].

Type ⅢCRISPR/Cas 系统主要在古细菌中发现，包括 typeIII-A 和typeIII-B 两种类型，两者的差

别主要是 A 型干扰的靶标是m RNA,B 型干扰的靶标是DNA[11], 其中 typeIII-B 系统与其他

1 或2 种CRISPR 亚单位相结合[9].

typeIII-B 系统特征性蛋白是 Cas10 蛋白，而 Cas10 蛋白具有 RNA 活性参与 cr RNA 的成熟和剪

切入侵外源 DNA[9,10].

最近几年，CRISPR/Cas 技术因其相对较为简单，而得到较为迅速的发展，如在作物育种、基

因治疗以及动物建模等领域都已得到广泛的应用[12].随着测序技术的不断发展，越来越多的细

菌和古细菌的基因组信息被解密，为后续 CRISPR/Cas 系统的改造和应用提供更加有力的指

导。

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摘要：

CRISPR/Cas作用机制及最新研究成果基因组编辑是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[1].基因组编辑技术日益成为生物学研究的热点，目前基因组编辑技术主要包括巨核酶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应因子核酸酶技术及CRISPR相关核酸酶技术[2].它们在基因工程中已经得到了诸多成功的应用，然而上述传统的基因组编辑技术存在明显的不足。例如，锌指核酸梅（zinc-fingernucleases,ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸梅（transcriptionac...

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