对β-香树素合酶的cDNA的相关研究

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对β-香树素合酶的 cDNA 的相关研究

金铁锁 Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C.Y. Wu 是石竹科单种属金铁锁属植物，分布于云

南、贵州、四川和西藏等省，主产于云南西北部、中部和东北部。金铁锁被列为国家二级保护

“ ”植物，是云南白药的主要组成药材之一，主要以根入药，具有散瘀定痛、止血、消痈排脓的

功效，用于跌打损伤、风湿痛、胃痛、创伤出血等的治疗。长期以来，金铁锁完全靠野外采

挖，加之自然生长缓慢，因而野生资源迅速减少，自然产量大幅降低。金铁锁资源已经不能满

“ ”足云南白药等中成药的需求。

但金铁锁皂苷结构复杂，人工合成困难，天然资源来源限制，欲从分子生物方面着手对此类化

合物的主要合成途径进行研究。金铁锁的主要有效成分为金铁锁皂苷（主要为三萜皂苷元），

具有抗炎和镇痛等重要药理活性。三萜皂苷（triterpenoid saponins）是一类重要的植物次生代

谢产物，广泛分布于植物界中，有抗菌和抗虫害的作用，可用作药物，具有重要的商业价

值。β-香树素合酶是三萜皂苷合成中关键酶，2, 3- 氧化鲨烯经过 2, 3-氧化鲨烯环化酶（OSC）

的环化作用得到三萜类骨架，然后在 β- 香树素合酶作用下得到 β-香树素，再经过一系列酶的催

化，包括细胞色素 P450、酰基转移酶以及糖苷转移酶等生物转化最后得到极具药用价值的五

环三萜皂苷。本课题组将对 β-香树素合酶的 cDNA 进行相关研究，阐明其在三萜皂苷合成途径

中的关键步骤中的作用。为次生代谢产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础，对三萜皂苷的

生物合成机制探究有重要意义。

1 材料与试剂

1.1 材料

样品采自西藏林芝，批号为 20060822，由云南中医学院钱子刚教授鉴定为石竹科金铁锁属植物

金铁锁 Psammosilene tunicoides W. C.Wu et C.Y.Wu 的根。

1.2 试剂

试剂 SMARTTMRACE cDNA ampification kit（Clontech 公司），LATaq（TaKaRa 公

司），Plasmidmini kit I（IBiomiga 公司），bacterial protein extractionkit（Bio Basic 公

司），NucleoTrap Gel Extraction Kit（Clontech 公司），pMD18-T Vector（TaKaRa 公

司），pMD20-T Vecto（rTaKaRa），pEASYTM-E1 ExpressionKit （TransGen Biotech 公

司）， Trans1-T1 PhageResistant Chemically Competent Cell （TransGenBiotech 公司）， BL21

（DE3 ）plysS ChemicallyCompetent Cell（TransGen Biotech 公司），IPTG（TransGen Biotech

公司），2, 3-氧化鲨烯（95%，Sigma 公司）及常用分子生物学试剂，硅胶 G 板（青岛海洋化

工有限公司）及其他生化试剂和分析纯试剂。

2 金铁锁 β-香树素合酶基因的获得

2.1 总RNA 的提取

采用 Trizol 法提取金铁锁根的总RNA。

2.2 RACE-ready first-strand cDNA 的合成

提取的总RNA 样品 1 μg ，按照 SMARTTMRACE cDNA ampification kit 说明书进行合成，产物

加100 μL Tricine-EDTA 缓冲液稀释，20 ℃保存备用。

2.3 5’- 和3’-RACE

以已得到的 β-AS 核心基因片段为模板，Primer5.0 设计 5’-和3’-RACE 反应引物，PBSS5：5’-

CTTCAACC-CAACAAGCCAACATACAC-3’ 和PBSS3：5’-GGAAG-

AGGTTCGTTGGTCCGATTAC-3’ ，按照 SMARTTMRACE cDNA ampification kit 说明

书，PCR 条件为94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5 个循环；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3

min，5 个循环；94 ℃、30 s，68 s，72 ℃、3 min，305 个循环；4 ℃终止。PCR 产物经 1%的

琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后插入pMD18-T Vector ，转入 Trans1-T1 感受态中，菌株在

含80 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上筛选，PCR 验证为阳性克隆的菌落测序。最后菌株80 ℃

保种。

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摘要：

对β-香树素合酶的cDNA的相关研究金铁锁PsammosilenetunicoidesW.C.WuetC.Y.Wu是石竹科单种属金铁锁属植物，分布于云南、贵州、四川和西藏等省，主产于云南西北部、中部和东北部。金铁锁被列为国家二级保护“”植物，是云南白药的主要组成药材之一，主要以根入药，具有散瘀定痛、止血、消痈排脓的功效，用于跌打损伤、风湿痛、胃痛、创伤出血等的治疗。长期以来，金铁锁完全靠野外采挖，加之自然生长缓慢，因而野生资源迅速减少，自然产量大幅降低。金铁锁资源已经不能满“”足云南白药等中成药的需求。但金铁锁皂苷结构复杂，人工合成困难，天然资源来源限制，欲从分子生物方面着手对此类化合物的主要...

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