精子表面GPI-APs鉴定的新方法
精子表面 GPI-APs 鉴定的新方法
糖基化磷脂酰肌醇( glycosylphosphatidylinositol( GPI) -锚定蛋白( APs) 是一类通过羧基末端的糖
基化磷脂酰肌醇锚定在细胞表面而不跨越膜磷脂双层的细胞膜蛋白． 该类蛋白广泛分布在真核
细胞表面，独特的结构使其具有水解酶、受体、粘附分子、补体调节蛋白等多种功能． 精子表
面GPI-APs 在精子发生、精子成熟、精子免疫保护、获能及顶体反应、精卵识别、男性不育及
生育等生理及病理过程中发挥重要的作用，但精子表面 GPI-APs 的鉴定研究尚不充分和系统．
嗜水气单胞菌毒素( aerolysin) 是由革兰氏阴性嗜水性气单胞菌分泌的外毒素，能与 GPI 锚蛋白
的GPI 锚基和 N-glycan 的多糖核心特异性结合． 本研究引入这种能特异性识别 GPI-APs 的细
菌毒素作为蛋白生物探针，通过三明治蛋白印迹及免疫荧光的方法鉴定精子表面的 GPI-APs．
1 材料与方法
1. 1 材料
嗜水性气单胞菌株购自中国科学院水生生物研究所; 标准嗜水性气单胞菌毒素( proaerolysin) 购
自加拿大萨省大学; 荧光标记的嗜水性气单胞菌毒素 FLAER( Alexa-488 Proaeroysin) 购自加拿
大Protox 公司; 嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体( 兔源多抗) 自制; 碱性磷酸酶标记 Protein
A/G、PVDF 膜( 0. 45μm) 购自 Pierce 公司; 蛋白酶混合抑制剂( ProteaseInhibitor Cocktail Set Ⅲ)
购自 Calbiochem 公司; 酵母提取物、胰蛋白胨( Tryptone) 购自 OXOID 公司; 弗氏完全佐剂
( Freund adjuvant complete) 、弗氏不完全佐剂( Freund adjuvantincomplete) 、TX100、TX114 及
PEG20 000 购自 Sigma 公司; 蛋白预染 Marker 购自 Fermentas 公司; 硫酸铵( 分析纯) 购自北京化
学试剂公司; 其余试剂均为国产分析纯． Sephadex G-100、1. 5 × 100 cm 层析住、2 × 50 cm 层
析柱以及 AKTA 蛋白色谱纯化及回收系统购自 GE 公司; Spectrapor 透析 袋 ( 分子截留12 000
～14 000 kD) 购 自 Spectrum 公司，荧光显微镜购自 Nikon 公司． 新西兰雌性长耳兔购买于北
京大学医学部实验动物中心．
1. 2 ———毒素制备 菌株复苏与扩大培养
无菌吸管吸取 0.3 ～0.5 mL 营养肉汤加入到装有真空冷冻干燥的菌种安瓿管内，冻干菌株溶解
呈悬浮状． 吸取全部菌体悬液，移植于斜面培养基中，30℃培养箱中培养 36 h 后，挑取乳白
色菌苔用连续分区划线法接种至培养皿中，继续培养 24 h ． 挑取培养皿中单个菌落，研磨法接
种于盛有5 mL LB 肉汤培养基的 50 mL 灭菌离心管中，在 30℃恒温振荡器中( 150 r/ min) 培养
12 h 后倒入250 mL LB 肉汤培养基，继续培养 36 h，菌液离心3 000 r/min，15 min，上清回收
待用．
1. 3 毒素提纯
回收的菌液上清在冰浴条件下，采用硫酸铵沉淀法初步提纯回收毒素． 然后用 Sephadex G-100
色谱柱纯化毒素，色谱条件: 平衡液及洗脱液均为 50 mmol / L Tris-HCl，pH 7. 8 缓冲液，流速
12 mL / h ，按4 mL/ 管收集，上样量为柱体积5% ( 即为6 mL 粗提毒素，上样浓度为5 ～10
mg/mL) ．紫外280 nm 进行检测，回收吸收峰段的样品即为提纯的毒素，提纯的毒素装入透析
袋埋入PEG20 000 中浓缩．
1. 4 兔抗毒素多克隆抗体制备
用嗜水气单胞菌毒素( aerolysin) 免疫雌性成年新西兰大耳兔，首次免疫后每隔 2 周加强免疫 3
次，首次免疫将弗氏完全佐剂乳化，加强免疫以弗氏不完全佐剂乳化，每次免疫的毒素蛋白量
约为0. 1 mg．3 次加强免疫后，耳缘静脉无菌取血，Western 印迹检测血清抗体的效价，第8
周再加强免疫 1 次，2 周后颈总动脉取血制备血清．
1. 5 大鼠精子膜脂筏成份提取
摘要：
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精子表面GPI-APs鉴定的新方法糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol(GPI)-锚定蛋白(APs)是一类通过羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇锚定在细胞表面而不跨越膜磷脂双层的细胞膜蛋白．该类蛋白广泛分布在真核细胞表面，独特的结构使其具有水解酶、受体、粘附分子、补体调节蛋白等多种功能．精子表面GPI-APs在精子发生、精子成熟、精子免疫保护、获能及顶体反应、精卵识别、男性不育及生育等生理及病理过程中发挥重要的作用，但精子表面GPI-APs的鉴定研究尚不充分和系统．嗜水气单胞菌毒素(aerolysin)是由革兰氏阴性嗜水性气单胞菌分泌的外毒素，能与GPI锚蛋白的G...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
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时间：2024-04-20
