染色技术在软骨细胞爬片中的运用

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染色技术在软骨细胞爬片中的运用

骨关节炎发病机制及治疗措施的研究中经常用到细胞学水平的研究，观察软骨细胞的形态结构

成为实验中的一种重要的方法。在过去的研究中[1 -3]，人们对软骨大体标本的特殊染色技术已

经进行了大量的改良，并应用于骨关节炎的研究中，取得了良好的效果，但是对于软骨细胞水

平的染色技术发展缓慢，以至于无法用简便的方法对细胞形态进行观察，对研究造成了不便。

本研究利用 C57BL /6J 小鼠进行软骨细胞的原代培养，对软骨细胞爬片进行 HE 染色、番红 O-

固绿双染色、SA-β 半染糖苷酶衰老染色及 II 型胶原免疫组化染色，探讨这几种染色技术在软

骨细胞爬片中的染色规律及应用价值，为骨关节炎细胞水平研究提供便利的条件。

1 材料和方法

1. 1 实验材料

1. 1. 1 实验动物及实验环境：出生 7 d 内的健康 SPF 级C57BL /6J 小鼠 12 只【动物合格证号：

No:44007200018611】，雌雄不限，体重（4 ± 1 ）g,实验用小鼠够购买自广东省医学实验动物

中心【生产许可证号： SCXK （粤） 2013-0002; 使用许可证号： zSYYX （粤） 2013-0002】，

饲养于北京大学/香港科技大学医学中心深圳医院实验动物中心【使用许可证号：SYXK （粤）

2010-0106】SPF 级屏障区域的 PVC 鼠笼内，持续过滤通气，自由饮食，清洁饮水，每日保持

12 h 光照 / 黑暗循环。实验流程和小鼠处理均遵循实验动物管理规范条例。

1. 1. 2 实验仪器：高压灭菌器（日本 Hirayama 公司） , 用于实验材料的灭菌；电热鼓风干燥箱

（中国精宏公司） , 用于灭菌材料的干燥；纯水机（美国 Millipore 公司） , 用于试剂配制；恒

温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司） , 用于试剂复温；生物洁净工作台（中国苏净公司） ,

用于实验操作；微量移液枪（Thermo fisher ）, 用于试剂配制及细胞培养；高速冷冻离心机

（德国Sigma 公司） , 用于细胞离心；培养箱（德国Themo 公司） , 用于细胞培养；光学显微

镜（德国Leica 公司） ,用于细胞观察及拍照。

1. 1. 3 实验试剂： II 型胶原一抗、goat anti-rabbitIgG H&L （Cy3 ? ）preadsorbed 9 购自 Abcam

公司，生物素化兔抗山羊 IgG、SABC-POD、DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公

司，fast greensolution、safranin O solution 购自 Scytek 公司，细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂

盒购自碧云天公司，Collagenase 、胰酶购自Worthington 公司，改良型 RPMI-1640 培养基购

自HyClone 公司，青/ 链霉素溶液购自伊科赛公司，胎牛血清购自 Life 公司，0. 4%台盼蓝溶

液购自广州晶欣公司，二甲苯、无水乙醇、30% H2O2 购自广州化学试剂厂，苏木素购自广州

速聚生物有限公司，中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司，伊红Y 购自行知生物科技有限

公司。

1. 1. 4 试剂配制：软骨细胞培养液：改良型 RPMI-1640 培养基90 mL, 胎牛血清10 mL; 4% II

型胶原酶消化液： collagenase 粉末 4 g,PBS 96 mL.

1. 2 实验方法

1. 2. 1 小鼠膝关节软骨细胞的分离培养：取出生 7d 以内的 C57BL /6J 小鼠 12 只，全部实验动

物气管窒息法处死，置于75% 酒精中浸泡 5 min, 取出小鼠用碘伏消毒膝关节处； PBS 漂洗 3 遍

各3 min; 将组织块剪切成1 mm3; 加入含有双抗的4% II 型胶原酶中于 37℃、5% CO2 培养箱

中消化4 h; 充分吹打细胞消化液，200 目过滤收集滤液； 1 500 r/min 离心5 min, 无菌 PBS 清洗

并离心2 次；弃上清液加入 6mL 完全培养基重悬细胞沉淀，接种至培养瓶中；于 37℃ 、5%

CO2 培养箱中培养观察，1 3∶比例传代，取 3 代以内的细胞进行实验。

1. 2. 2 软骨细胞爬片的制作：准备多聚赖氨酸溶液浸泡后的24 孔板大小的盖玻片于超净台中

晾干；5 代以内的软骨原代细胞消化后台盼蓝计数，配制成 1 × 105/ mL 细胞悬液； 24 孔板中

加入少许培养基，将细胞悬液均匀滴到玻片上；常规培养 6 h 等到细胞贴壁后，再滴加培养基

布满整个板底，继续培养至 24 h.

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摘要：

染色技术在软骨细胞爬片中的运用骨关节炎发病机制及治疗措施的研究中经常用到细胞学水平的研究，观察软骨细胞的形态结构成为实验中的一种重要的方法。在过去的研究中[1-3]，人们对软骨大体标本的特殊染色技术已经进行了大量的改良，并应用于骨关节炎的研究中，取得了良好的效果，但是对于软骨细胞水平的染色技术发展缓慢，以至于无法用简便的方法对细胞形态进行观察，对研究造成了不便。本研究利用C57BL/6J小鼠进行软骨细胞的原代培养，对软骨细胞爬片进行HE染色、番红O-固绿双染色、SA-β半染糖苷酶衰老染色及II型胶原免疫组化染色，探讨这几种染色技术在软骨细胞爬片中的染色规律及应用价值，为骨关节炎细胞水平研究提供...

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