四羟基环孢菌素衍生物菌株发酵配方和培养条件优化

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四羟基环孢菌素衍生物菌株发酵配方和培养条

件优化

放线菌是一群革兰阳性、G+C%含量高达 55%的细菌，属原核生物类群，在自然界中分布很

广，因其菌落呈放线状而得名。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗

生素约 70%是由各种放线菌产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂，如细胞色素 P450

酶(CYP)。CYP 是一类血红素结合蛋白，可修饰各种天然化合物，包括多酮类化合物、脂肪酸

类固醇和一些芳香族化合物。

环孢菌素具有高效免疫抑制作用，抗 HIV-1 病毒和逆转肿瘤多药耐药性等作用。但是，环孢菌

素的肝肾毒性以及生物利用度低等缺点影响了它在这些领域的开发利用。因此，对环孢菌素的

免疫抑制作用机制等生物活性进行研究，并在此基础上寻找作用特异、毒副作用低、生物利用

度高、活性更强的低毒高效衍生物已成为世界范围内研究开发环孢菌素的一个热点。有研究表

明稀有放线菌 Nonomuraea dietziae 具有重要的工业意义，它编码表达的 CYP 蛋白区域选择性羟

基化环孢菌素 A，得到四羟基环孢菌素衍生物[γ-HyMeLeu4]CyA，为了更好的开展[γ-

HyMeLeu4]CyA 工业化生产，提高收益，降低生产成本，本研究对该菌株发酵配方和培养条件

进行优化，最终使[γ-HyMeLeu4]CyA 摇瓶效价提高了 63%左右。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

稀有放线菌 Nonomuraea dietziae ZL-10-3 由本实验室保存。

1.1.2 培养基

(1)分离及斜面培养基(%) 酵母粉 0.4，麦芽粉 1.0，葡萄糖 0.4，琼脂 2.0，pH7.0。

(2)种子培养基(%) 淀粉 1.0，葡萄糖 0.7，麦芽粉 0.5，酵母粉 0.5，蛋白胨 0.5，碳酸钙

0.7，pH7.0。

(3)发酵培养基同种子培养基。

1.2 方法

1.2.1 斜面培养

用竹签挑选单个菌落转接于斜面培养基，28℃下培养 15d。

1.2.2 摇瓶培养

斜面上的孢子接种于种子培养基中，28℃，220r/min 培养 44~48h，然后以 10%的接种量接种于

发酵培养基中，28℃，220r/min 摇床培养，24h 后向发酵培养基中添加底物环孢菌素 A，添加

量为 300μg/mL，添加底物后的培养时间为 120h。

1.2.3 发酵条件优化

在40mL 的三角瓶发酵体系(总容积 250mL)中，按 1.2.2 的发酵条件，分别对底物添加时间，添

加量和添加底物后的培养时间进行优化研究。

1.2.4 样品检测

4mL 发酵液倒入刻度离心管中，加入1mL 无水乙醇，3000r/min 离心10min 后取上清液，HPLC

法测发酵效价(μg/mL)。

2 结果和分析

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摘要：

四羟基环孢菌素衍生物菌株发酵配方和培养条件优化放线菌是一群革兰阳性、G+C%含量高达55%的细菌，属原核生物类群，在自然界中分布很广，因其菌落呈放线状而得名。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是由各种放线菌产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂，如细胞色素P450酶(CYP)。CYP是一类血红素结合蛋白，可修饰各种天然化合物，包括多酮类化合物、脂肪酸类固醇和一些芳香族化合物。环孢菌素具有高效免疫抑制作用，抗HIV-1病毒和逆转肿瘤多药耐药性等作用。但是，环孢菌素的肝肾毒性以及生物利用度低等缺点影响了它在这些领域的开发利用。因此，对环孢菌素的免疫抑制作用机制等生...

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