间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的作用
间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能
蛋白表达的作用
来源：学术堂 作者：姚老师
发布于：2014-05-20 共2776 字
研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生骨量减少和骨质疏松症。其发生机理至今尚未明
确，多项临床研究显示，与持续性高血糖相比，间歇性高血糖对糖尿病患者的微血管及大血管
损伤更为显著，并可增加心血管死亡风险。
然而，间歇性高血糖对成骨细胞乃至骨的影响，目前尚无相关研究。因此，本实验中我们以小
鼠颅骨成骨细胞为研究对象，研究间歇性高糖环境对于成骨细胞的形态、细胞增殖及功能蛋白
表达的影响。
1、对象与方法
1.1 实验对象
取出生 3日内的健康新生 KM 小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），拉颈处死，75%酒精
中浸泡 20min 后，取出颅骨，剔除附着于颅骨上的结缔组织及骨膜，PBS 冲洗至其呈白色后，
用眼科剪将颅骨剪碎成 1mm×1mm×1mm 的碎骨片，将其用 0.25%胰蛋白酶于 37℃恒温下消化
10min，吸弃消化液，加入 0.2% Ⅱ的 型胶原酶中 37℃消化 20min，收集消化液，重复 3次。将
消化液置于离心管中，1500r/min 离心 8min，去上清，所得白色沉淀即为成骨细胞。加入含有
15%胎牛血清与 1%双抗的 HDMEM 培养基重悬细胞，将其接种于培养瓶中。细胞在
37℃、5%CO2、95%O2、100％湿度的孵箱中培养。根据细胞生长情况以及培养液 pH 值变化
选择 2～3天换液一次，待细胞 80％～90％融合时传代，传代后，改用含有 10%胎牛血清与 1%
双抗的 LDMEM 培养基培养细胞。BCIP/NBT 碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞，细胞传代接种。
对数生长期的第 3代成骨细胞随机分为 3组：5.5mmol/L 正常糖浓度组、25mmol/L 持续性高糖
组、5.5mmol/L～25mmol/LQD 间歇性高糖组，分别检测干预 1w、2w 及3w 后成骨细胞形态学
变化，收集上清液 OCN 及ALP 分泌情况取第三代成骨细胞，调整细胞终密度为 5000 个/孔，
细胞接种于 96 孔板中，共设四块平行培养板置培养箱中培养 24h，观察大部分细胞已经贴壁，
吸弃培养基。将细胞分成上述3个组，每个浓度组设5个重复孔（含不同糖浓度培养基、含细
胞）和 3个空白孔（即只含培养液、不含细胞），培养液总体积均为200μL/孔，培养 48h、72h
后，每孔避光加入 20μLMTT 溶液，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，
每孔加入 150μLDMSO，振荡 10min，使结晶物溶解，于 490nm 波长处测定各孔吸光度（OD）
值，取平均值。
1.2 实验方法
用放射免疫法（RIA）检测细胞上清液中骨钙素含量，比色法检测细胞上清液中碱性磷酸酶
（ALP）的含量。
1.3 统计学分析
所得数据均采用SPSS17.0 软件系统分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，对符合正态
分布的计量资料，组间指标的比较均采用独立样本的 t检验。对非正态分布的资料，进行对数
转换，若无法转换，则采用非参数秩和检验进行组间比较，以 P＜0.05 为差别有显著性意义。
2、结果
2.1 不同糖浓度环境对成骨细胞形态学的影响在正常糖浓度环境下，各组成骨细胞形态未见明
显变化（图1A）。在高糖环境下，随着干预时间的延长，细胞形态逐渐出现变异，以 3w 组最
为明显。间歇性高糖组（图1C）较正常糖浓度组及持续性高糖组（图1B）细胞生长能力明显
减弱，细胞间连接融合减少，部分细胞呈多角形，细胞浆内颗粒增多，细胞核边缘模糊，部分
摘要：
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间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的作用来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-05-20共2776字研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生骨量减少和骨质疏松症。其发生机理至今尚未明确，多项临床研究显示，与持续性高血糖相比，间歇性高血糖对糖尿病患者的微血管及大血管损伤更为显著，并可增加心血管死亡风险。然而，间歇性高血糖对成骨细胞乃至骨的影响，目前尚无相关研究。因此，本实验中我们以小鼠颅骨成骨细胞为研究对象，研究间歇性高糖环境对于成骨细胞的形态、细胞增殖及功能蛋白表达的影响。1、对象与方法1.1实验对象取出生3日内的健康新生KM小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），拉颈处死，75...
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作者：闻远设计
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