间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的作用

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间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能

蛋白表达的作用

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-05-20 共2776 字

研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生骨量减少和骨质疏松症。其发生机理至今尚未明

确，多项临床研究显示，与持续性高血糖相比，间歇性高血糖对糖尿病患者的微血管及大血管

损伤更为显著，并可增加心血管死亡风险。

然而，间歇性高血糖对成骨细胞乃至骨的影响，目前尚无相关研究。因此，本实验中我们以小

鼠颅骨成骨细胞为研究对象，研究间歇性高糖环境对于成骨细胞的形态、细胞增殖及功能蛋白

表达的影响。

1、对象与方法

1.1 实验对象

取出生 3日内的健康新生 KM 小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），拉颈处死，75%酒精

中浸泡 20min 后，取出颅骨，剔除附着于颅骨上的结缔组织及骨膜，PBS 冲洗至其呈白色后，

用眼科剪将颅骨剪碎成 1mm×1mm×1mm 的碎骨片，将其用 0.25%胰蛋白酶于 37℃恒温下消化

10min，吸弃消化液，加入 0.2% Ⅱ的型胶原酶中 37℃消化 20min，收集消化液，重复 3次。将

消化液置于离心管中，1500r/min 离心 8min，去上清，所得白色沉淀即为成骨细胞。加入含有

15%胎牛血清与 1%双抗的 HDMEM 培养基重悬细胞，将其接种于培养瓶中。细胞在

37℃、5%CO2、95%O2、100％湿度的孵箱中培养。根据细胞生长情况以及培养液 pH 值变化

选择 2～3天换液一次，待细胞 80％～90％融合时传代，传代后，改用含有 10%胎牛血清与 1%

双抗的 LDMEM 培养基培养细胞。BCIP/NBT 碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞，细胞传代接种。

对数生长期的第 3代成骨细胞随机分为 3组：5.5mmol/L 正常糖浓度组、25mmol/L 持续性高糖

组、5.5mmol/L～25mmol/LQD 间歇性高糖组，分别检测干预 1w、2w 及3w 后成骨细胞形态学

变化，收集上清液 OCN 及ALP 分泌情况取第三代成骨细胞，调整细胞终密度为 5000 个/孔，

细胞接种于 96 孔板中，共设四块平行培养板置培养箱中培养 24h，观察大部分细胞已经贴壁，

吸弃培养基。将细胞分成上述3个组，每个浓度组设5个重复孔（含不同糖浓度培养基、含细

胞）和 3个空白孔（即只含培养液、不含细胞），培养液总体积均为200μL/孔，培养 48h、72h

后，每孔避光加入 20μLMTT 溶液，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，

每孔加入 150μLDMSO，振荡 10min，使结晶物溶解，于 490nm 波长处测定各孔吸光度（OD）

值，取平均值。

1.2 实验方法

用放射免疫法（RIA）检测细胞上清液中骨钙素含量，比色法检测细胞上清液中碱性磷酸酶

（ALP）的含量。

1.3 统计学分析

所得数据均采用SPSS17.0 软件系统分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，对符合正态

分布的计量资料，组间指标的比较均采用独立样本的 t检验。对非正态分布的资料，进行对数

转换，若无法转换，则采用非参数秩和检验进行组间比较，以 P＜0.05 为差别有显著性意义。

2、结果

2.1 不同糖浓度环境对成骨细胞形态学的影响在正常糖浓度环境下，各组成骨细胞形态未见明

显变化（图1A）。在高糖环境下，随着干预时间的延长，细胞形态逐渐出现变异，以 3w 组最

为明显。间歇性高糖组（图1C）较正常糖浓度组及持续性高糖组（图1B）细胞生长能力明显

减弱，细胞间连接融合减少，部分细胞呈多角形，细胞浆内颗粒增多，细胞核边缘模糊，部分

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摘要：

间隔性高糖条件对成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的作用来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-05-20共2776字研究发现，糖尿病患者较正常人更易于发生骨量减少和骨质疏松症。其发生机理至今尚未明确，多项临床研究显示，与持续性高血糖相比，间歇性高血糖对糖尿病患者的微血管及大血管损伤更为显著，并可增加心血管死亡风险。然而，间歇性高血糖对成骨细胞乃至骨的影响，目前尚无相关研究。因此，本实验中我们以小鼠颅骨成骨细胞为研究对象，研究间歇性高糖环境对于成骨细胞的形态、细胞增殖及功能蛋白表达的影响。1、对象与方法1.1实验对象取出生3日内的健康新生KM小鼠（购自福建医科大学动物实验中心），拉颈处死，75...

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