肺动肺平滑肌细胞的分离与培养新方法

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肺动肺平滑肌细胞的分离与培养新方法

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-05-19 共5920 字

与体循环不同，肺循环血流阻力低，血管压力低，血管壁薄，可扩展性好，肝源性肺损伤可引

起肺循环相应的组织结构改变。肝肺综合症是在肝病和／或门静脉高压的基础上出现的肺血管

扩张和肺小血管增生为特征，且与肝病相关的动脉血氧合作用异常而导致的一类综合征，在肝

硬化病人中的发生率在５％～３２％。近年来，肝肺综合征发病过程中，肺动脉平滑肌细胞的

异常增值和迁移是可能是形成肺微血管扩张和血管增生的一个重要机制。因此，肺动肺平滑肌

细胞的分离、培养成为研究肺血管壁细胞生物学行为及血管增生性疾病发生发展中的重要手

段。然而，目前成人肺动脉平滑肌细胞（ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏ

ｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，ＰＡＳＭＣｓ）体外培养受制约的因素较多，很难获得

成功。本实验旨在通过改良的组织块法建立稳定的成人肺动脉平滑肌细胞体外培养的模型，为

开展肝源性肺损伤相关的实验奠定良好的基础。兹将改良成人肺动脉平滑肌细胞分离、培养和

鉴定的方法报道如下。

１材料和方法

１．１材料

胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国）、青霉素和链霉素（ｓｉｇｍａ公司，美国）、高糖

ＤＭＥＭ／Ｆ１２１：１培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国）、ＰＤＧＦ－ＢＢ（武汉博

士裕┖停埃２５％胰蛋白酶（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国），ＴｒｉｔｏｎＸ－１００� �

（北京索莱宝公司）；ＳＭ－α－ａｃｔｉｎ和ｃａｌｐｏｎｉｎ单克隆抗体（Ａｂｃａｍ公

司，英国），ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ和ＤＡＰＩ、抗荧光淬灭封片液（上海碧云天公

司），生物安全操作柜、ＣＯ２细胞培养箱、振荡器（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ公司，

美国），低温离心机（ｅｐｐｅｎ－ｄｏｒｆ公司，德国），电控恒温水浴箱（天津市泰斯特

有限公司产品），倒置相差显微镜及荧光显微镜ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）。

１．２平滑肌细胞的分离与培养

征得患者同意后无菌条件下取良性病变肺叶切除手术中废弃的肺叶用无菌生理盐水清洗去除血

污。用眼科镊分离出细小肺动脉并撕去平滑肌外膜，眼科剪刀纵行剪开血管，内膜面朝上，轻

轻刮去内膜组织。获得干净光滑的血管段，将剥离的血管中膜用眼科剪剪成约１ｍｍ× １ｍｍ

大小的碎片。将组织块贴附于培养瓶底，每次可以接种２～４瓶，并每瓶加入４～５ｍＬ含２

０％胎牛血清、１０ μｇ／ＬＰＤＧＦ、１００Ｕ／ｍＬ青霉素及１００ｍｇ／ｍＬ链霉素的

含高糖ＤＭＥＭ／Ｆ１２１∶１的培养基。

１．３传代细胞的培养

当原代细胞长出并逐渐相互交融形成致密单层细胞时即可传代培养。首先吸去培养液，用无菌

ＰＢＳ溶液洗涤３次。加入０．１％胰蛋白酶覆盖细胞表面消化，在倒置相差显微镜下观察，

约１ｍｉｎ后，可见大部分细胞收缩变形，边缘分界清楚，此时翻转培养瓶，加入含有１０％

胎牛血清的培养液以终止胰蛋白酶，停止消化。用滴管轻轻吹打分散细胞制成细胞悬液，取悬

液于离心管内８００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去上清液后再加入１０％培养基，轻轻吹

打分散细胞制成细胞悬液后，按１∶２瓶的比例，接种到新的培养瓶中进行培养，每天观察细

胞形态，据细胞生长情况，约３ｄ换液１次。

１．４平滑肌细胞形态观察

在倒置相差显微镜下观察平滑肌细胞生长状况。

１．５平滑肌细胞鉴定

取第３代细胞生长接近单层盖玻片，吸出培养液，依次加入４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，

℃ ０．１％Ｔｒｉ－ｔｏｎＸ－１００３０ｍｉｎ，３％Ｈ２Ｏ２１ｍＬ，３７３０ｍｉ

ｎ，用一抗（α ℃－ＳＭ－ａｃｔｉｎ１∶１００、ｃａｌｐｏｎｉｎ１∶２００），３７

孵箱过夜，再分别加入二抗（抗兔ＦＩＴＣ－ＩｇＧ１∶１００）３０ｍｉｎ和ＤＡＰＩ复

染１５ｍｉｎ，每次加入试剂前后均用ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次，滴加少量抗荧光淬灭试

剂，封片，在荧光显微镜下观察结果。用血管平滑肌细胞特异的 α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ、ｃａ

ｌｐｏｎｉｎ抗体进行免疫组织化学方法的染色，应用荧光显微镜下观察每个视野中染色阳性

的细胞占所有细胞的比例。

２结果

２．１肺动脉平滑肌细胞形态观察结果

（１）原代培养平滑肌细胞：倒置相差显微镜下观察，成人ＰＡＳＭＣｓ沿组织块爬出时间为

７～９ｄ，细胞呈长梭形，有突起并相互接触。见图１。细胞培养至第１３～１５天，开始进

入对数生长期，并且组织块之间的细胞呈现出典型的" 峰谷" 征象。见图２。

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肺动肺平滑肌细胞的分离与培养新方法来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-05-19共5920字与体循环不同，肺循环血流阻力低，血管压力低，血管壁薄，可扩展性好，肝源性肺损伤可引起肺循环相应的组织结构改变。肝肺综合症是在肝病和／或门静脉高压的基础上出现的肺血管扩张和肺小血管增生为特征，且与肝病相关的动脉血氧合作用异常而导致的一类综合征，在肝硬化病人中的发生率在５％～３２％。近年来，肝肺综合征发病过程中，肺动脉平滑肌细胞的异常增值和迁移是可能是形成肺微血管扩张和血管增生的一个重要机制。因此，肺动肺平滑肌细胞的分离、培养成为研究肺血管壁细胞生物学行为及血管增生性疾病发生发展中的重要手段。然而，目...

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