对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究

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对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的

研究

来源：解剖学报作者：常玉巧;李辞霞;贾阳阳

发布于：2018-07-04 共8362 字

摘要：目的探讨心脏成纤维细胞（CFs ）生物表型多样性。方法新生 13 天SD 大鼠 12 只，

胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新 60 只生大鼠 CFs, 比较原代和传代培养细胞形态学变

化，免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白（vimentin ）、成纤维细胞特异

性蛋白 1 （FSP1 ）和盘状结构域受体（DDR2 ）的表达，细胞免疫荧光检测 CFs 干细胞标记

nanog、c-kit、sca-1、CD73 和CD90 的表达，细胞免疫荧光三标技术检测 CFs 干细胞标记间的

共表达情况。结果酶联合消化法分离培养的 CFs 收获细胞量大，第 3代细胞活力好、纯度

高。Vimentin、FSP1 和DDR2 在CFs 中均表达，但 DDR2 在CFs 中呈强表达。部分 CFs 分别

表达 nanog、c-kit、sca-1、CD73 和CD90, 部分 nanog 阳性的 CFs 分别和 CD73、CD90 和sca-1,

及其 CD90 和sca-1 存在共表达， nanog+/CD73+ 共表达阳性率最高（59.02%±8.39% ）, 与其他

3 组相比差异均有极显着性（P<0.01 ）;而nanog+/CD90+共表达阳性率与 nanog+/sca-1+之间差

异无显着性（P>0.05 ）, 但这两组与 CD90+/sca-1+ 相比差异均有极显着性（P<0.01 ）

;CD90+/sca-1+共表达阳性率均低于其他 3 组，差异具有极显着意义（P<0.01 ）. 结论 CFs 是具

有干细胞特征混合细胞群，在表型上具有多样性。

关键词：心脏成纤维细胞；干细胞标记；细胞培养；免疫组织化学；新生大鼠；

Multiple phenotypes in cardiac fibroblasts

Abstract:Objective To explore the multiple phenotypes in cardiac fibroblasts （CFs ）. Methods CFs

of neonatal rats were isolated from twelve 1-3-day neonatal SD rats and cultured using combined type

I collagenase （w/v, 0. 1% ）trypsin （w/v, 0. 25% ）digestion method. Morphological

characteristics were observed between primary and subcultured CFs. Common molecular markers for

fibroblasts such as vimentin, fibroblast specific protein （FSP1 ）and discoidin domain receptors 2

（DDR2 ）were detected by immunohistochemical staining. Nanog, c-kit, sca-1, CD73 and CD90

recognized as stem cell markers were evaluated in CFs by immunofluorescence staining, and co-

expression of those markers was investigated by three-color immunofluorescence technology. Results

By the combined enzyme digestion method, the isolated fibroblasts had large volume. Passage 3 cells

exhibited good biological activity, fast proliferation and high purity. Vimentin, FSP1 and DDR2 were

all expressed and DDR2 was strongly expressed in CFs. Nanog, c-kit, sca-1, CD73 and CD90 were

detected in some CFs. Interestingly, CD73, CD90 and sca-1 were co-expressed with nanog positive

CFs respectively and the result showed the positive expression rate of nanog+/CD73+was the highest

than other three groups （59. 02% ± 8. 39% ）. It had significant different （P < 0. 01 ）. while the

positive rate of nanog+/CD90+in CFs had no different with the rate of nanog+/sca-1+ （P > 0. 05 ）.

And the rate of nanog+/CD90+and nanog+/sca-1+ had extremely significant different with the rate of

CD90+/sca-1+ （P < 0. 01 ）. But the positive rate of CD90+/sca-1+ was significantly lower than

that in the other three groups （P < 0. 01 ）. Conclusion CFs have several subpopulations with stem

cell characteristics and multiple phenotype.

Keyword:Cardiac fibroblast; Stem cell marker; Cell culture; Immunohistochemical staining; Neonatal

rat;

心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs ）占心脏细胞总数的 50%~70%, 是心肌组织重要的支

持细胞，抗缺氧损伤能力强，即使是在长期纤维化状态下，仍具有较高的增殖和代谢活性[1].

传统观念认为，成纤维细胞是一群均一的细胞，在不同的器官组织中，发挥其支持和分泌功

能。近期研究发现，成纤维细胞具有显着异质性，表现在细胞形态大小[2]、增殖特性[3], 胶

原合成[4], 分泌细胞因子和细胞表面受体等[5]. 前期研究发现，不同器官成纤维细胞在细胞形

态、生长增殖和表面受体表达等方面具有显着异质性，且成纤维细胞具有间充质干细胞样特

性，表现出多向分化潜能[6,7].但CFs 是否存在干细胞分子标记的表达差异，以及干细胞标记

的重叠表达等，目前尚鲜见报道。

本研究拟采用体外分离培养技术和免疫细胞化学技术，探讨 CFs 表达干细胞标记 nanog、c-

kit、sca-1、CD73 和CD90 及其共表达情况，进一步确定 CFs 的不同亚群，为进一步开发利用

成纤维细胞提供可靠的实验支持，为组织损伤原位修复提供更丰富的种子细胞来源奠定实验基

础。

材料和方法

1. 实验材料

1~3 d SD 新生大鼠 12 只，体重（7.1±0.31 ）g, 雌雄不限，由新乡医学院实验动物中心提供，

动物合格证号：SCXK （豫） 2010-0002.

2. 方法

2.1 CFs 分离培养和传代：

新生大鼠称重后处死，无菌条件下取心脏，预冷 PBS 冲洗，剔除心房，大血管和结缔组织，

用眼科剪将组织剪成约1 mm3 小块，加入 0.1%胶原酶 I （Roche 公司）和 3倍体积的0.125%

胰蛋白酶（Sigma 公司）, 37℃10 min, 吸管充分吹打，上清加入等体积含低糖完全培养基

[DMEM （Hyclone 公司）+10% 胎牛血清（Hyclone 公司）] 终止消化，直到组织小块完全消

化为止，1200 r/min 离心 5 min, 完全培养基重悬沉淀，接种至25 cm2 培养瓶中， 40 min, 弃上

清，加入完全培养。48 h 后首次更换完全培养基，以后每2 d 换液，待细胞汇合约85% 时，

胰蛋白酶细胞消化液（含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA ）, 37℃ ，2 min, 消化贴壁细胞，以

1 3∶ 接种传代扩大培养，细胞汇合近 70% 时，4% 多聚甲醛固定备用。

2.2 细胞免疫组织化学染色：

经固定过的细胞爬片，PBS 冲洗，3%H2O2 孵育 5~10 min, PBS 冲洗，山羊血清室温封闭

10~15 min.分别滴加山羊抗大鼠盘状结构域受体 2 （discoidin domain receptor 2, DDR2 ）多克隆

抗体（1 300, ∶美国 Santa Cruz 公司）、兔抗大鼠成纤维细胞特异性蛋白 1 （fibroblast specific

protein, FSP1 ）多克隆抗体（1 200, ∶美国 Abcam 公司）和兔抗大鼠波形蛋白（vimentin ）多

克隆抗体（1 500, ∶美国 Abcam 公司）, 4℃ 过夜，PBS 冲洗，滴加相应的生物素化二抗工作

液，37℃孵育 20 min, PBS 冲洗，滴加 HRP 标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP ）, 室温孵育

12 min.空白对照为PBS 代替一抗，其余相同。DAB 显色，苏木素复染细胞核，自来水返

蓝，光学显微镜下观察，图像采集和分析。

2.3 细胞免疫荧光染色：

经固定过的细胞爬片，PBS 冲洗，0.3%Triton 透膜 10 min, PBS 浸洗 3 次，每次 3min.正常山

羊血清室温封闭 20 min, 分别滴加兔抗大鼠 sca-1 多克隆抗体（1 200, ∶德国 Merck 公司）、兔

抗大鼠 c-kit 单克隆抗体（1 300, ∶美国 Santa Cruz 公司）、兔抗大鼠 nanog 多克隆抗体

（1 200, ∶美国 Santa Cruz 公司）、小鼠抗大鼠 CD90 单克隆抗体（1 500, ∶美国 Abcam 公

司）和小鼠抗大鼠 CD73 单克隆抗体（1 300, ∶美国 BD 公司）, 4℃ 过夜，PBS 冲洗，PBS

漂洗 3 次，每次 5 min; 滴加相应二抗， 37℃孵育 40 min, PBS 漂洗 3 次，每次 5 min;5 mg/L

DAPI 室温孵育 5 min, 抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并摄片。空白对照为PBS 代

替一抗工作液，其余步骤相同。荧光显微镜下行图像采集。

2.4 细胞免疫荧光三标染色：

经固定过的细胞爬片，除分组加入一抗（具体分组见表 1 ）外，其余步骤同上。

2.5 数据统计学处理：

免疫荧光数据均采用 SPSS17.0 软件进行统计学分析。随机各取 30 个视野，按下列公式计算：

共表达率=共表达细胞数/有核细胞总数。结果以均值± 标准差（?±s ）表示，两样本均数比较

采用独立样本 t 检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，检验标准α=0.05, P<0.05 为

差异有统计学意义。

结果

1.体外培养不同代次CFs 形态学比较

酶联合消化法体外分离培养的 CFs 活力好，增殖能力强，传 2~11 代（P2~P11 ）后的 CFs 增

殖能力与原代细胞比较，均显示出同样的增殖能力。传代后的 CFs, 尽管受到细胞消化液中酶

的作用，但在增殖期内仍表现出很强的适应性，增殖能力继续保持稳定。在光学显微镜下观

察，CFs 形态多样，大小不一。呈三角形、梭形、星形和多边形，胞核较小，双核细胞约占

40%, 偶见3 核细胞（图1 ）.5~7 d 细胞铺满培养皿底部，约有85%CFs 聚集，呈现出漩涡状

或放射状分布（图1 ）.培养 7 d “ ” 后，细胞大部分交叉重叠，形成编织状外观。

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摘要：

对心脏成纤维细胞是否在表型上具有多样性的研究来源：解剖学报作者：常玉巧;李辞霞;贾阳阳发布于：2018-07-04共8362字摘要：目的探讨心脏成纤维细胞（CFs）生物表型多样性。方法新生13天SD大鼠12只，胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs,比较原代和传代培养细胞形态学变化，免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白（vimentin）、成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）和盘状结构域受体（DDR2）的表达，细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达，细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况。结果酶联合...

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