低环多环芳烃对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性机制

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来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-08-29 共3570 字

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, 简称 PAHs) 是存在于环境中且含有两个以上苯环的

碳氢化合物,包括菲、芘、苯并芘(BaP) 等150 余种. 近年来,人类活动的加剧,特别是煤、石油等

化石燃料和木材的不完全燃烧,破坏了其在环境中原有的平衡, 使环境中 PAHs 大量增加. 作为一

种典型的持久性有机污染物,PAHs 类化合物已在世界各地被检出, 此外 PAHs 类化合物还具有强

烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用,可以通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体,是最早发现

也是数量最多的致癌物之一. 由于 PAHs 独特的性质,其也具有生物蓄积性和半挥发性,因此是大

气污染监测的重要目标之一.

肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage, 简称 AM) 是存在于肺泡隔中较大的圆形或卵圆形巨噬细胞,

可吞噬、清除外来的尘粒或病原,参与肺的防御和免疫,还可产生大量的生物活性物质,维持肺和

机体的正常生理活动.菲是一种典型的三环芳香烃,易挥发,很多条件下以气态存在,可经呼吸系统

进入人体,对动物有致癌作用.目前关于菲对植物生长发育的影响有一些报道,研究结果表明氧化

损伤为菲毒性的可能机制,而关于菲对动物毒性作用的报道并不多.本文以菲为研究对象,测定了

染毒后细胞中谷胱甘肽 (Glutathione,GSH) 、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD) 和丙二

醛(Malondialdehyde,MDA) 含量,观察了线粒体融合/分裂状态, 以此探讨低环多环芳烃对大鼠 AM

的毒性机制.

1 、材料和方法

1.1 仪器和主要试剂

CO2 培养箱(Thermo Forma 公司) 、低温高速离心机(Thermo Forma 公司) 、TU-1810 紫外可见

分光光度计(北京普析通用仪器公司) 、HZQ-F100 振荡培养箱、酶标仪、激光共聚焦显微

镜.RPMI1640 培养液、小牛血清、MDA 试剂盒、SOD 试剂盒、GSH 试剂盒、二甲基亚砜

(DMSO) 、0.4%的台盼蓝、四甲基偶氮唑盐(MTT) 、考马斯亮蓝 G-250、0.18%胰蛋白酶、菲

母液(5 mg·mL-1 甲醇) 、线粒体荧光试剂(Mito-Tracker Green) .

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠 AM 的提取和培养

每次实验选体重 220—250 g 的雄性、清洁Wistar 大鼠 4 只, 腹腔注射 1% 戊巴比妥那 1.0 mL,腹

主动脉放血致死,打开胸腔,用灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS,pH = 7.0) 灌洗双肺,灌洗液(BLAF) 于

3000 r·min-1、4 ℃ 离心 10 min,弃上清液, 沉淀用含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养液洗涤,台盼

蓝拒染法计数,稀释(2×106—3×106 个·mL-1) , 将细胞稀释液按每皿 3 mL 分装于细胞培养皿中,置

于37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 2 h,小心弃原培养液, 用PBS 轻轻洗涤 1—2 次,去除非贴壁的细

胞.

用不同浓度的菲(20、40、60、80、100 μg·mL-1) 染毒,同时设对照组(只加培养液) . 染毒 4 h,去

培养液, 以PBS 清洗后用 0.18%的胰蛋白酶消化细胞,30 s 后弃消化液, 用含小牛血清的

RPMI1640 培养液终止消化,轻轻吹打贴壁的细胞, 将悬液转移到 10 mL 离心管中, 于3000 r·min-

1、4 ℃ 离心 10 min,用PBS 清洗两次, 之后加少许 PBS 冻存,备用.

1.2.2 细胞毒性的测定

采用MTT 分析法. 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为溶解于二甲基亚砜

(DMSO) ———的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan) , 用酶标仪在 490 nm 波长处测其吸收值,可间接反

映活细胞数量.

将稀释好的细胞悬液(1—2×105 个·mL-1) 按每孔 100 μL 加到96 孔培养板中, 贴壁 2 h 后,用不同

浓度的含菲培养液100 μL 染毒,同时设一对照组(只加培养液) 、空白组(只加甲醇) 和一标准组

(只加MTT 和DMSO) , 每个浓度设 5 个平行, 染毒 4 h 后,去原培养液, 每孔加100 μL RPMI 1640

培养液和20 μL MTT(5 mg·mL-1) 继续培养,4 h 后去上清液, 每孔加150 μL DMSO, 振荡 10 min,

将液体平行转移到另一96 孔板中, 在酶标仪上测 OD 值,计算细胞的相对存活率.

1.2.3 AM 线粒体融合 / 分裂的观察

观察线粒体融合/ 分裂所用的荧光试剂为 Mito-Tracker Green. 不同浓度菲染毒 4 h 后, 用0.18%的

胰酶消化细胞,30 s 后, 用含小牛血清的 1640 培养液终止消化, 终止液转移到 10 mL 离心管

中,3000 r·min-1、4 ℃ 离心 10 min,去上清液, 沉淀加入 37 ℃ 预温育的染色工作液1 mL,浓度为

25 nmol·L-1, 孵育30 min 后,3000 r·min-1、4 ℃ 离心 10 min,弃上清, 重新加入培养液500 μL,用移

液器吹打均匀,取一滴做标片, 在激光共聚焦显微镜下观察 AM 线粒体融合/分裂的状态.

1.2.4 生理指标的测定

蛋白含量测定: 以牛血清白蛋白为标准溶液(1 mg·mL-1) , 作蛋白含量

0、10、20、30、40、50、60 μg 的标准曲线,采用考马斯亮蓝法, 于595 nm 波长下测其吸光值,

通过标准曲线测得样品中的蛋白含量.SOD、GSH 及MDA 含量用试剂盒测定(购自南京建成公

司) ,具体方法参见试剂盒说明书.

1.2.5 统计分析

实验数据以平均值±标准误差(Mean±SD) 表示, 用Excel 软件对组间差异进行统计分析,P<0.05 表

示差异显著, 用Origin 8.0 完成制图与分析.

2 、结果与讨论

2.1 菲的细胞毒性

AM 是重要的吞噬细胞,可以清除肺中的坏疽碎片及尘埃等, 当病原体被 AM 吞噬后,会与溶酶体

融合并被消化掉, 而AM 也将死于消化过程中产生的混合物. 如图 1 所示,随染毒浓度的增加,AM

成活率呈下降趋势,低浓度(20 μg·mL-1) 组相对于较高浓度组(80 μg·mL-1、100 μg·mL-1) 而言,

产生的混合物较少,AM 成活率下降较缓, 当浓度大于 40 μg·mL-1 时,染毒组与对照组相比差异达

显著或极显著水平(P<0.05 或P<0.01) . 图1 空白为只加甲醇时的细胞成活率(以最大染毒浓度组

的甲醇体积计算) ,与对照组相比,无显著性差异.

2.2 不同浓度菲对 AM SOD 活力的影响

SOD 是保护细胞免受自由基侵袭的第一道屏障, 能够催化O-·2 与H2O2 反应生成O2.SOD 作为

重要的抗氧化酶,广泛存在于生物体内,SOD 能及时修复受损细胞,复原自由基对细胞造成的伤害,

但当有毒有害物质的浓度过高, 产生的 O2-过多, 超出 SOD 的清理能力时,SOD 活力就会减弱.如

图2 所示,随着染毒剂量的增加,SOD 活力呈下降趋势,说明细胞的抗氧化能力减弱. 在浓度大于

80 μg·mL-1 时,与对照组相比,差异极显著(P<0.01) .

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低环多环芳烃对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性机制来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-29共3570字多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbons,简称PAHs)是存在于环境中且含有两个以上苯环的碳氢化合物,包括菲、芘、苯并芘(BaP)等150余种.近年来,人类活动的加剧,特别是煤、石油等化石燃料和木材的不完全燃烧,破坏了其在环境中原有的平衡,使环境中PAHs大量增加.作为一种典型的持久性有机污染物,PAHs类化合物已在世界各地被检出,此外PAHs类化合物还具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用,可以通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体,是最早发现也是数量最多的致癌物...

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