大鼠SSCs微滴培养技术的探索
大鼠 SSCs 微滴培养技术的探索
来源：学术堂 作者：刘老师
发布于：2014-05-24 共6174 字
精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是精了发生的前体细胞，也是雄性个体体内唯一可
以终生保持白我更新和增殖并将遗传信息纵向传递给后代的特殊干细胞群体。多年来，SSCs
在细胞生物学、内分泌学和生殖医学的极大发展前景一直被人们所重视。深入研究 SSCs 的相
关生物学特性有助于阐明精了发生的机制，对 SSCs 的进一步应用研究也具有重要意义。因
此，SSCs 的体外培养也成为了当今生物科学研究的热点问题。
1994 年，Brinster 等[2-3]建立了 SSCs 移植技术，此后 SSCs 的研究便得到了空前的发展。近年
来，又建立了小鼠 SSCs 的体外长期培养和增殖方法[4-5]随后，科学家们又建立了大鼠 SSCs 的
体外培养和增殖方法。然而，在培养过程中对 SSCs 的生长过程却并不完全了解。能否建立一
种方法可以对 SSCs 进行少量细胞的培养并保证较高的成活率，直接得到 SSCs 的细胞簇。在探
讨此问题的过程中，用微滴培养技术培养 SSCs 引起了我们的兴趣[6] 。
微滴培养技术最早始于 Brinster 在1963 年所创建的液体石蜡覆盖微滴培养法，其最早应用于卵
了和胚胎的培养，这种用石蜡油覆盖的小滴培养对卵了和胚胎细胞的观察以及收集定量性的数
据是特别有帮助的。同时，在单位体积中培养适当数量的细胞，能够保证细胞正常生长，维持
培养液滴正常的渗透压。微滴法从此开始被许多研究者采用，现在也成为许多体外受精项目中
的标准操作[8]。最近，日本研究组将微滴培养技术成功应用于小鼠 SSCs 的体外增殖培养[9]。
研究人员使用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞，利用显微操作技术将 SSCs 转移到微滴中
进行培养，获得了成功。研究指出，在 SSCs 的体外培养过程中，微滴培养技术的进一步成熟
会使我们更深刻地了解 SSCs 的体外生长机理和白我更新及分化的条件。
大鼠是实验室中研究得较多的一种实验动物，在医药以及生物学领域已有超过白万篇科研文献
是以大鼠为实验动物的。然而，目前还没有较好的方法建立转基因大鼠，从而限制了大鼠的应
用。小鼠研究已经显示，将转基因的 SSCs 移植到受体鼠肇丸，能传递供体的遗传信息，产生
转基因的后代.将小鼠 SSCs 操作技术应用于大鼠研究，已经繁育出转基因大鼠.但是，大鼠
SSCs 操作技术的核心部分之一，即SSCs 的长期培养，仍然存在技术难点。本研究对大鼠
SSCs 微滴培养技术进行探索，用少量数目明确的大鼠 SSCs 进行体外培养，实现了大鼠 SSCs
的扩增。免疫荧光双标记染色和体外诱导分化分析鉴定显示，微滴培养技术能维持大鼠 SSCs
的标记分了表达特性和分化能力，适用于少量大鼠 SSCs 的增殖培养。
1 材料与方法
1.1 材料
Wistar-Iamichi 大鼠由内蒙古大学动物实验中心国家二级清洁型动物房繁育。本研究的大鼠
SSCs 由本实验室提供[l3]。实验中采用了 p一琉基乙醇(SERVA), Amphotericin B(BBI)、链霉素
(BBI),青霉素(日本和光株式会社)、MEMa(GIBCO),DMEM/F 12(GIBCO)·丝裂霉素(浙江海正药
业)、丙酮酸钠(日本和光株式会社)、谷氨酞胺(日本和光株式会社)、石蜡油(Sigma), EDTA(上
海生工生物工程有限公司)、Trpsin(AMRESCO)、胎牛血清(FBS，天津濒洋生
物)、BSA(Sigma)、正常山羊血清封闭液(BOSTER), Hoechst(SIGMA), Triton-x1 oo}sIGMA)、卵
泡刺激素(FSH，宁波第二激素厂)、肇酮(宁波第二激素厂)、60 mm 培养皿(CORNING),12 孔板
(CORNING)、无血清细胞冻存液(Sigma),细胞生长因了 GDNF(PROSPEC),
Gfral(R&DSYSTEMS), bFGF(PROSPEC) ，其他化学试剂均为国产分析纯。
大鼠 SSCs 染色实验所用的一抗:抗CDH1 抗体(Santa Cruze)、抗OCT4 抗体(Abc am)、抗PLZF
抗体(Santa Cruze)、抗Thyl 抗体(Santa Cruze)、抗GFRaI 抗体(Santa Cruze);二抗:CY3 偶联的山
羊抗小鼠 IgG(碧云天生物技术有限公司)、FITC 偶联的山羊抗兔 IgG(碧云天生物技术有限公
司)。SSCs 分化后染色所用一抗:抗Scp3 抗体(Santa Cruze);二抗:CY3 偶联的山羊抗兔 IgG(碧云
天生物技术有限公司) 。
细胞核染料 Hoechst33342(Sigma) o1.2 大鼠精原干细胞的分离纯化及鉴定用 2224 d 的大鼠，按
Zhang 等[l4]的方法分离纯化制备大鼠 SSCs。大鼠精原干细胞的体外培养参照 Kubota 等的方法
进行，用丝裂霉素处理的 STO 细胞做为滋养层，用无血清培养液进行精原干细胞培养。
1.3 微滴的制备
采用 60 mm 培养皿作为微滴承载器皿，每培养皿12 个微滴，每个微滴含有20 pL SSC 培养液
[14-16]。每个微滴内接种丝裂霉素 C处理的 STO 细胞(1 }2) X 106}mL 作为滋养层细胞[l7]，在
液滴表面覆盖 3 mL 石蜡油。
用同样方法制作 6个微滴培养皿。在 37 0C, 5% COz 的饱和湿度细胞培养箱(BINDER)中过夜培
养后，按文献[13]的方法利用显微操作技术将大鼠 SSCs 定量转移至培养皿的微滴中进行微滴培
养。
1.4 大鼠 SSCs 的微滴培养
(1)将确定数目的大鼠 SSCs 转移至微滴中进行培养:利用显微操作技术将。、5, 8, 10, 20, 40 个
SSCs 分别转移至6个60 mm 培养皿的72 个微滴中，每个培养皿的微滴内只接种相同数目的细
胞，每组有 12 个重复数据。加入细胞后，在微滴内连续吹吸 8次从而使微滴内的 SSCs 均匀接
触滋养层细胞。将培养皿置于37 0C, 5% COz 的细胞培养箱进行细胞培养。每隔 2d 更换SSCs
培养液。必要时补充适量的滋养层细胞。
(2)定时对微滴内的细胞进行观察并照相:每次换液时用 Nikon TE2000-U 倒置显微镜对培养的
SSCs 进行观察照相。培养至一个月时，一部分微滴中的 SSCs 用于细胞固定和免疫荧光染色鉴
定，其余微滴中的 SSCs 收集起来用于体外诱导分化实验。
1.5 免疫荧光双标染色鉴定
张岩等证实，CDH1 也可以作为大鼠 SSCs 的标记分了，可以用于大鼠 SSCs 的鉴定。因此，本
实验用 CDH1 作为主抗体，与其他四种抗体(OCT4,PLZF, Thy120, Gfra12)组合成为四组进行免
疫荧光双标染色鉴定，即OCT4-CDH1, PLZF-CDH1,THY1-CDH1, Gfral-CDH1。取在微滴连续
培养一个月的SSCs，小心吸去微滴内的培养液，用 4%多聚甲醛对微滴内的细胞室温固定1 h,
DPBS 洗涤 5次，随后用正常山羊血清对细胞进行室温封闭处理30 minx 封闭后向四个微滴中
加入第一种一抗(CDH1)(1:80 稀释),40C 过夜。吸去一抗，用 DPBS 洗涤 5次以除去未结合的
IgG，再向4个微滴中加入Cy3 偶联的二抗(1:100 稀释)(Goat-anti-mouse)，室温孵育 30 min，用
DPBS 洗涤 5次以除去未结合的二抗 IgG。第二种一抗如果其抗原是胞内蛋白就要进行通透处
理。随后向 4个滴内分别对应加入OCT4, PLZF, T 场1,Gfral 四种一抗，4 0C 过夜，用 DPBS 洗
涤5次以除去未结合的IgG，加入FITG 偶联的二抗((1:100 稀释)(goat-anti-rabbit)共孵育 30
min，使用 DPBS 洗涤 5次，再对4个滴进行 Hoechst33342(1:1 000 稀释)染色，DPBS 洗涤 5次
后加入新鲜的DPBS，用 Nikon TE2000-U 倒置荧光显微镜进行观察照相。
1.6 SSCs 的体外诱导分化首先，将 12 孔板的两个孔标记为A, B，用 0.2gelatin 处理，培养板置
于37 0C 恒温培养箱1h，然后吸去 gelatin 处理液，用 PBS 洗3遍。在 A, B 两孔中分别加入山
羊肇丸支持细胞 1 X 106/mL(Sertoli cells，由本实验室提供[}ZZ')，在含10% FBS 的DMEM/F
12 培养液中，37 0C, 5% COz 培养过夜。缓慢吸出支持细胞培养液，向 A孔中加入微滴培养
摘要：
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大鼠SSCs微滴培养技术的探索来源：学术堂作者：刘老师发布于：2014-05-24共6174字精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSCs)是精了发生的前体细胞，也是雄性个体体内唯一可以终生保持白我更新和增殖并将遗传信息纵向传递给后代的特殊干细胞群体。多年来，SSCs在细胞生物学、内分泌学和生殖医学的极大发展前景一直被人们所重视。深入研究SSCs的相关生物学特性有助于阐明精了发生的机制，对SSCs的进一步应用研究也具有重要意义。因此，SSCs的体外培养也成为了当今生物科学研究的热点问题。1994年，Brinster等[2-3]建立了SSCs移植技术，此后SSCs的研究便...
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时间：2024-07-13
