miR-17对原代细胞细胞周期的影响

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miR-17 对原代细胞细胞周期的影响

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-06-16 共4546 字

细胞衰老是指细胞生长永久阻滞于细胞周期的 G1 期，出现形态、生化及表观遗传的变化特

性，是正常细胞必然的归宿[1].衰老细胞的聚集会导致其所在组织或器官发生衰老相关性疾

病，去除这些衰老细胞则会延缓疾病的发生，从而延缓整个生物体的衰老。此外，研究表明细

胞衰老是继细胞 DNA 修复和细胞凋亡之后的第三大癌症防御机制，与肿瘤的发生、发展以及

治疗密切相关。

MicroRNA 是长约 21 ~ 23nt 的非编码 RNA, 通过特异性抑制靶 mRNA 翻译或者降解 mRNA 来

调节靶基因的表达[2].miRNA-17-92 家族位于人 13 号染色体上，编码 miR-17-5p （miR-

17 ）、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a,miR-20a、miR-19b 及miR-92a 7 个成熟的 miRNAs.近年

研究发现，miRNA-17-92 家族在心、肺、免疫系统的发育中发挥重要作用[3-4],并与前列腺

癌、肺癌、乳腺癌及胃癌等多种肿瘤的发生密切相关[5-7]. 作为 Oncomirs 领域第一个被发现的

癌基因，miR-17-92 家族的研究受到广泛的关注[8].Matthias 等[9]通过芯片分析发现，miR-

17、miR-19b、miR-20a 和miR-106a 在复制性衰老的细胞中表达下调，但具体机制尚未明确。

本实验通过分离培养原代人包皮成纤维细胞（ human foreskinfibroblasts,HFF ）, 研究 miR-17 对

原代细胞细胞周期的影响，初步探讨 miR-17 调节细胞衰老的分子机制。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 细胞培养包皮标本来源于山东大学齐鲁医院泌尿外科 l 例7 岁健康男孩包皮环切术切除

的包皮，患者签署知情同意书，同意包皮用于医学科学研究。本研究已获得山东大学医学院伦

理委员会批准。HFF 传代培养于含 10% 小牛血清的 DMEM 高糖培养基，在 37 ℃、5%CO2 细

胞培养箱内培养。

1. 1. 2 主要试剂 DMEM 高糖培养基购自美国 Hyclone 生物化学制品有限公司，小牛血清购自杭

州四季青生物工程有限公司，聚凝胺（polybrene ）和嘌呤霉素（puromycin ）均购自美国

Sigma 公司，重组慢病毒Lenti-miR-17 和Lenti-NC 均购自上海吉玛制药技术有限公司，逆转录

及PCR 反应试剂盒购自日本TaKaRa 公司，兔抗人波形蛋白（vimentin ）单克隆抗体购自北

京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所公司，衰老相

关β-gal 染色试剂盒购于美国 CST 公司，p21 一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，cyclin D1

购自美国 Santacruz 公司，PVDF 膜购自美国 Millipore 公司，ECL 试剂购自上海碧云天生物技

术有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 HFF 的分离和体外培养手术剪去皮下组织和真皮网状层，剪成1 mm3 大小皮片；用

PBS 反复漂洗 3 次；加入胰酶，37 ℃ 温箱消化1 ~2 h; 加入 DMEM 培养基，轻轻吹打，200 目

不锈钢滤网过滤，将细胞液1 000 r/min 离心 10 min,弃上清，加入 DMEM 培养基漂洗 2 次，每

次离心 5 min, 所得细胞用含 10% 小牛血清的 DMEM 培养基混匀并转移至培养瓶中静置培养，

每两天换一次；待原代培养中长出的成纤维细胞接近或达到汇合，按1 3 ∶的比例传代培养。

1. 2. 2 培养 HFF 细胞的鉴定将原代 HFF 细胞接种在细胞爬片上，培养至细胞接近融合状态，

以兔抗人波形蛋白（Vimentin ）单克隆抗体为一抗，用链酶亲和素- 生物素- 过氧化物酶（

SABC ）法进行免疫细胞化学染色。显微镜下观察并拍照。

1. 2. 3 稳定表达 miR-17 成纤维上皮细胞系的建立与筛选待 HFF 细胞长至70% 左右，弃去原培

养液，用 PBS 冲洗一遍，加入含miR-17 重组慢病毒的DMEM 培养基（ MOI = 50 ）,同时加

入8 μg / mLpolybrene 促进病毒的感染，将细胞放置 37 ℃ 孵箱孵育24 h,弃去含病毒的培养

基，改换 DMEM 培养基。24 h 后，消化病毒感染的 HFF, 将细胞接种至100 mm 培养

皿，同时加入 puromycin 进行筛选。荧光倒置显微镜观察HFF-miR-17 及HFF-NC GFP 表达。

1. 2. 4 qRT-PCR 检测 HFF 中miR-17 的表达 Trizol 抽提细胞 RNA, 逆转录合成cDNA,miR-17 检

测引物（扩增长度：246 bp,Tm = 56 ℃ ）: 上游：5'-CT-GTCGCCCAATCAAACTG-3', 下游：

5'-GTCACAA-TCCCCACCAAAC-3'; GAPDH: 上游5'-GCACCGT-CAAGGCTGAGAC-3', 下游5'-

TGGTGAAGACGC-CAGTGGA-3'.qRT-PCR 反应条件按日本TaKaRa 公司 SYBR PrimeScript

miRNA RT-PCR Kit 说明书操作。

1. 2. 5 细胞生长曲线测定取 HFF-NC 和HFF-miR-17 对数生长期细胞制成单细胞悬液，接种到

96 孔板中，每孔 1. 5 ×103 个细胞，每24 h 取3 个孔换液后加入含10% CCK-8 的DMEM 培养

液，在培养箱内孵育1 h, 用酶标仪测定在450 nm 处的OD 值，连续计数 6 d. 以OD 值为纵坐

标、时间为横坐标绘制生长曲线。

1. 2. 6 β- 半乳糖苷酶染色将HFF-miR-17 细胞及其对照细胞用常规方法在 6 孔板中培养，细胞

密度达到 60% ~ 80% 时开始染色，倒掉细胞培养基，PBS 冲洗一次，加3% 的甲醛固定 5 min;

PBS 冲洗，加入 1 mL / 孔新鲜配置的SA-β-gal 染液，用封口膜封住 6 孔板防止液体蒸发，37

℃ 无CO2 培养箱中过夜；倒置显微镜下观察是否有变蓝色的衰老细胞，并拍照保存。

1. 2. 7 流式细胞术检测细胞周期待培养皿中细胞生长至对数生长期，向培养瓶内加入 10 pg

/mL 的博来霉素（Bleomycin ）, 培养 24 h.终止培养，胰酶消化收集细胞，用细胞计数板进行细

胞计数，据细胞数量调节每管细胞数为（ 0. 5 ~1. 0 ）×106 个，PBS 洗3 遍，弃上清，每管加

入1 mL 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4 ℃固定 12 h 以上。PBS 洗涤去乙醇，1000r /min,5 min,

离心半径 13. 5 cm, 洗2 遍。将细胞重悬于含 RNase A （70 μg /mL ）的 PBS-propidiumio-dide（

PI,50 μg / mL ）, 避光反应 30 min. 用流式细胞仪测定细胞周期，并用 FlowJo software 进行细胞

周期分析。

1. 2. 8 Western blotting 检测 p21 和cyclin D1 蛋白表达冰上加裂解液裂解细胞，离心取上

清，BCA 法测蛋白浓度，蛋白上样50 μg, 经10% SDS-PAGE 垂直凝胶电泳后，移至 PVDF 膜

上，5% 脱脂奶粉 37 ℃ 摇床封闭 2 h, 用特异性抗p21,cyclin D1 和GAPDH 的一抗进行孵育，4

℃ 过夜，经TBST 冲洗 10 min × 3 次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃ 摇床孵育1

h,TBST 冲洗 10 min × 3 次，ECL 显影曝光。

1. 3 统计学处理采用GraphPad Prism 4. 0 软件，并在实验组间进行双因素方差分析检验。P <0.

05 为差异有统计学意义。实验结果均重复 3 次。

2 结果

2. 1 HFF 细胞的鉴定见图 1.由于波形蛋白为成纤维细胞内的特异性蛋白，实验组用兔抗人波形

蛋白单克隆抗体作为一抗，采用SABC 法对细胞进行免疫化学染色，显微镜下观察，细胞呈长

梭形或多角形，细胞胞浆呈棕色，胞核为淡蓝色，显示为人皮肤成纤维细胞。

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摘要：

miR-17对原代细胞细胞周期的影响来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-06-16共4546字细胞衰老是指细胞生长永久阻滞于细胞周期的G1期，出现形态、生化及表观遗传的变化特性，是正常细胞必然的归宿[1].衰老细胞的聚集会导致其所在组织或器官发生衰老相关性疾病，去除这些衰老细胞则会延缓疾病的发生，从而延缓整个生物体的衰老。此外，研究表明细胞衰老是继细胞DNA修复和细胞凋亡之后的第三大癌症防御机制，与肿瘤的发生、发展以及治疗密切相关。MicroRNA是长约21~23nt的非编码RNA,通过特异性抑制靶mRNA翻译或者降解mRNA来调节靶基因的表达[2].miRNA-17-92家族位于人13...

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