ApoAI对视网膜Müller细胞增殖与凋亡的影响

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ApoAI 对视网膜 Müller 细胞增殖与凋亡的影响

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-11-07 共3150 字

糖尿病视网膜病变( diabetic retinopathy,DR) 是糖尿病的最主要并发症之一,是严重致盲性眼病;

视网膜 Müller 细胞是 DR 的主要参与细胞. 而ApoAI 是高密度脂蛋白( HDL) 的主要载脂蛋白,其

在胆固醇逆向转运、抑制低密度脂蛋白( LDL) 的氧化修饰、前列环素的稳定、保护血管内皮细

胞以及稳定细胞膜结构中发挥重要作用[1].最近研究表明,ApoAI 是主要的抗粥样硬化因子[2].国

内已有报道中国糖尿病人群 ApoAI 显着低于健康人群[3], 而apoB 与ApoAI 的比值显着高于健

康人群[4], 作者拟研究 ApoAI 对Müller 细胞增殖与凋亡的影响, 以期探讨视网膜 Müller 细胞参

与DR 的始动因素.

1 材料与方法

1. 1 人视网膜 Müller 细胞的原代培养

按朱茂丽等[5]报道的方法稍加改进进行细胞培养: 取角膜移植后的眼杯( 取自于苏州大学第三

临床医学院眼科) , 自锯齿缘后 1 ~2 mm 处环形剖开眼球,去除眼前部组织及玻璃体,留后半眼球

壁于 DMEM 培养液中,轻轻剥取视网膜组织,将视网膜组织放于含 DMEM 培养基的一次性塑料

培养皿中, 在解剖显微镜下将视网膜组织剪成约 1 mm ×1 mm 大小的组织块制成组织块悬液,离

心弃上清, 加入 5 倍组织块体积的 0. 25% 的胰酶悬浮组织块, 细胞培养箱放置 5 min 后取出加入

等体积的 20% FBS 的DMEM 培养液后用移液器轻轻吹打 10 次,离心弃上清, 加入 20% FBS 的

DMEM 培养液再次制成组织块悬液接种于培养瓶中,置于恒温恒湿培养箱( 37 ℃, 体积分数为

5CO2) 中培养, 开始 1 周不换液,若培养液变黄则小心用移液器吸出部分培养液后加入新鲜培养

液, 待1 周后细胞爬出后换液, 见80%以上的细胞融合以后传代培养.经免疫组化鉴定培养出的细

胞为视网膜 Müller 细胞.

1. 2 实验分组与实验方法以 P3 代对数生长期的人视网膜 Müller 细胞用于实验, 当Müller 细胞达

80% 以上融合状态时予以 0. 25% 胰蛋白酶消化, 用含 20% FBS 的DMEM 培养液制成细胞悬液

接种至 6 孔培养板中,置于饱和湿度、37 ℃ 、体积分数为 5% % CO2 培养箱中孵育.24 h 后取出

6 孔培养板,小心吸弃原培养液, 用无FBS 的DMEM 培养液漂洗两次, 不同ApoAI 浓度组中分别

加入浓度为 0、0. 01、0. 1、1 μg·ml- 1 的DMEM 培养液 3 ml,置于饱和湿度、37 ℃ 、体积分数

为5% % CO2 培养箱中继续孵育 24 h.

倒置显微镜下观察各组Müller 细胞形态. 流式细胞术检测 Müller 细胞的细胞周期,0. 25% 胰酶消

化6 孔板中的细胞制成单细胞悬液并收集到流式管中,PBS 洗两次以除去其中的培养液和胰酶等

物质,然后使用美国BD 公司的DNA 异倍体染色试剂盒, 按照说明书依次加入 A、B、C 3 种试剂

后上机检测. 流式细胞术检测 Müller 细胞的凋亡,0.25%胰酶消化六孔板中的细胞制成单细胞悬

液并收集到流式管中,PBS 洗两次以除去其中的培养液和胰酶等物质,将细胞悬液离心弃上清后

加入 195 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞, 加入 5 μl Annexin V-FITC 轻轻混匀,室温( 20

~25 ℃ ) 避光孵育 10 min.1 000 g 离心 5 min,弃上清,加入 190 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重

悬细胞.加入 10 μl 碘化丙啶染色液轻轻混匀,冰浴避光放置,随即进行流式细胞仪检测.荧光显微

镜下观察凋亡细胞形态,按上述步骤处理细胞最后一步不进行流式细胞仪检测,而是离心收集细

胞后用 50 ~100 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞,涂片后于荧光显微镜下观察.

1. 3 统计学处理

实验数据均以均数± 标准差表示, 应用SPSS 统计软件进行单因素方差分析, 以P <0. 05 表示差异

有统计学意义.

2 结果

2. 1 不同药物浓度组 Müller 细胞形态.

各组Müller 细胞呈典型的多角形,大小均匀、边界清晰、形态无明显差异. 见图1.

2. 2 不同药物浓度组人视网膜 Müller 细胞的细胞周期分布采用单因素方差分析的统计方法,药物

处理后G1 期细胞百分比无明显变化( F =0. 432,P > 0. 05) ,S 期细胞百分比明显增多( F = 11.

007,P < 0. 05) ,G2 期细胞百分比明显降低( F = 20. 350,P < 0. 05) . 见表 1.

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ApoAI对视网膜Müller细胞增殖与凋亡的影响来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-11-07共3150字糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病的最主要并发症之一,是严重致盲性眼病;视网膜Müller细胞是DR的主要参与细胞.而ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白,其在胆固醇逆向转运、抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰、前列环素的稳定、保护血管内皮细胞以及稳定细胞膜结构中发挥重要作用[1].最近研究表明,ApoAI是主要的抗粥样硬化因子[2].国内已有报道中国糖尿病人群ApoAI显着低于健康人群[3],而apoB与ApoAI的比值显着高于...

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