龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞的抗衰老作用

3.0 闻远设计 2024-07-13 163 4 909.02KB 7 页免费

侵权投诉

龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞的抗

衰老作用

来源：日用化学工业作者：蒋丹丹,王风楼,李慧,

发布于：2021-08-11 共6665 字

　　摘　　　　要：通过重建老化皮肤细胞的体外评估模型，评估龙血复合物（一种由 4种活性成

分复合而成的活性物）对正常人皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞 ATP 含量和线粒体完整

性（包括：线粒体形态、线粒体网络和线粒体融合蛋白-1 的表达）的影响。ATP 检测试剂盒测

定成纤维细胞和角质形成细胞内 ATP 含量，荧光探针染色结合显微镜图像半定量方法评估线

粒体形态和线粒体网络结构的丰度，免疫细胞荧光染色方法分析线粒体融合蛋白-1(Mfn1)的表

达。实验结果显示，龙血复合物显着促进成纤维细胞和角质形成细胞 ATP 含量，显着促进角

质形成细胞线粒体网络的形成，龙血复合物处理的成纤维细胞线粒体形态完整、碎片较少、具

有更加丰富的分支结构，Mfn1 的表达水平更高。研究发现龙血复合物通过促进细胞 ATP 产

生、保持线粒体完整性、增加线粒体网络数、促进 Mfn1 的表达，显示出对成纤维细胞和角质

形成细胞的抗衰老作用。本研究中使用的评估方法也可用于筛选针对与线粒体衰老和生物能量

相关功能的活性成分。

　　　关键词 :　　皮肤衰老;龙血复合物;线粒体;线粒体网络;线粒体融合蛋白-1;

　　 Abstract： In this study, normal human skin cells extracted from an aged donor were used to

establish the in vitro senescent skin cell model. The bioenergetics effect was evaluated by measuring

cellular ATP content using CellTiter-Glo? Reagent. Microscopic inspection and the semi-quantitative

analysis methods of mitochondrial networks have been used to evaluate the mitochondria assembled

into flexible networks in metabolically active cells. In the meantime, immuno-cytochemistry staining

was used to futher understand the mechanism of mitochondria network formation, and the expression

of Mitofusin-1 was investigated. With this model, the efficacy of Dragon's Blood Complex( DBC), a

botanical complex composed of four active ingredients, was evaluated with normal human dermal

fibroblasts and epidermal keratinocytes about its biofunctions on ATP production and mitochondrial

integrity including morphology of mitochondria, aboundance of mitochondrial networks, and the

expression of Mitofusin-1. The results show that the ATP level in senescent fibroblasts and

keratinocytes is significantly increased by Dragon's Blood Complex. The relative ATP content of

fibroblasts is 117.7%±4.3% compared with the control group( P<0.01) when treated with 0.25% DBC.

When treated with 0.5%, 0.25%, and 0.1% DBC, the relative ATP content of keratinocytes, compared

with the control group, are 149.8%±9.0%, 147.5%±6.4%, and 134.0%±8.3%, respectively( P<0.001).

By incubation with 0.25% DBC, the count of mitochondrial network in senescent keratinocytes is

significantly promoted( P<0.05). And in the DBC-treated fibroblasts, the mitochondria networks are

less fragmented and more extensively branched in morphology. Besides, Mitofusin-1 is more widely

and abundantly expressed in the DBC-treated fibroblasts. This might partly explain the promotion

effect of DBC on mitochondria networks. In summary, DBC shows anti-aging effects on fibroblasts

and keratinocytes by promoting the cellular ATP and mitochondria. The evaluation method used in

this study can also be applied to the screening of more active ingredients targeting the functions

relevant with mitochondrial aging and bioenergetics.

　　 Keyword： skin aging; Dragon's Blood Complex; mitochondrion; mitochondrial network;

Mitofusin-1;

皮肤作为人体最大的外层器官，是衰老最明显的表现。皮肤衰老体现了皮肤完整性和功能

性的下降。与衰老相关的生物学过程中，线粒体能量产率下降、ROS 产量上升，线粒体自噬水

平下降，其功能异常成为加速细胞衰老的关键因素[1,2,3]。众所周知，生物体保持健康内稳态

离不开细胞的正常代谢运作，细胞代谢本质上就是活细胞内千万种放能反应和吸能反应的总

和，而放能反应和吸能反应之间能量传递的纽带就是 ATP “ ”分子，线粒体是细胞的能量工厂，

是细胞 ATP 的主要制造场所，以 ATP 的形式为内源性反应提供化学能。另外，线粒体还参与

多种细胞活动，如增殖、分化、氧化、衰老和凋亡。线粒体形态的变化与其功能密切相关，对

细胞命运和组织形成至关重要。在过去的十年中，研究探索了线粒体形态，发现线粒体融合和

裂变是一直动态存在的，当细胞处于较优生长条件下时，线粒体的融合率超过裂变率[4,5]，在

这种情况下，线粒体可以在代谢活跃的细胞中聚集成管网状结构。线粒体的网络结构与 ATP

产生增加、活性氧产生减少相关联，而碎片形态与 ATP 产生减少和线粒体解偶联相关。已经

报道了线粒体网络的显微镜观察法和半定量分析法[4,6]。目前，越来越多的证据表明线粒体稳

态与皮肤衰老之间存在相关性，为开发新的皮肤抗衰老药物和成分提供了支持。

本研究目的是使用老化皮肤细胞的体外评估模型，通过细胞学、生物化学、免疫细胞化学

等手段定量研究由 4种活性成分（麒麟竭（Daemonorops draco）、血满草（Sambucus

adnata）、鹰嘴豆（Cicer arietinum ――）、喜马拉雅冰川水）组成的植物复合物龙血复合物

（DBC）对正常人体皮肤细胞 ATP 水平变化的深层机理、ATP ――生产工厂线粒体的功能、

线粒体状态对皮肤细胞的影响，以及细胞呼吸过程中其他一些高能化合物对皮肤内稳态的影

响。

　 1 　、实验部分

　　 1.1 　、主要试剂与仪器

龙血复合物，麒麟竭提取物、血满草提取物、鹰嘴豆种子提取物与喜马拉雅冰川水按照一

定的比例组合配制而成；人皮肤成纤维细胞（FB）、人皮肤角质形成细胞（KC），从人皮肤

包皮组织（47 岁）中提取；DMEM 培养基、胎牛血清、Keratinocyte-SFM 培养基、Bovine

Pituitary Extract(BPE）、0.05%Trypsin-EDTA、F-12 培养基、DPBS、ATP 试剂盒，美国赛默飞

世尔公司；二甲基亚砜（DMSO），国药集团化学试剂有限公司。

无菌操作台、CO2 培养箱，美国赛默飞世尔公司；VICTORTM X4 酶标仪，美国珀金埃尔

默公司；EON 型微孔分光光度计，美国伯腾仪器有限公司；Leica SP8 激光共聚焦显微镜，德

国莱卡公司；Zeiss Scope A1 显微镜，卡尔・蔡司股份公司。

　 1.2　、实验方法

　　 1.2.1 　、龙血复合物对人体皮肤细胞毒性的测定

使用来自老化供体的人皮肤成纤维细胞（FB）和人皮肤角质形成细胞（KC），建立衰老

细胞的体外评估模型。细胞以 5 000 cells/孔接种于 96 孔板，每孔 100μL，贴壁后，换成0.5%

龙血复合物培养基，同时设置空白对照组（只添加培养基）。培养 48 h 后进行MTT 实验，每

孔加入200μL 0.5 mg/m L MTT 溶液，培养 3 h，小心吸除上清液，每孔加入100μL DMSO，设

置调零组（只加DMSO），轻轻晃动叩击 96 孔板，待完全融解后，用酶标仪在550 nm 处测定

其吸光度，计算细胞存活率。

　 1.2.2 　、龙血复合物对细胞内 ATP 的影响

基于细胞 ATP 的检测是评估细胞状态的一种较为灵敏的方法[7,8,9]。细胞以 5 000 cells/孔

接种于 96 孔板，每孔 200μL，培养 48 h 后换饥饿培养基，18 h 后换成0.5%龙血复合物培养

基，同时设置空白对照组（只添加培养基），培养 48 h 后使用 Cell Titer-Glo?试剂测量细胞

ATP 含量。吸出细胞培养上清，加入100μL 培养基，设置标准品孔，然后加入100μL Cell

Titer-Glo Reagent，轻晃孔板 2 min 混匀，诱导细胞裂解，室温避光反应 10 min，酶标仪读数

（Luminescence）。结合 ATP 标准曲线处理测试数据。

　 1.2.3　、线粒体形态、网络定量和线粒体融合蛋白-1(Mfn1）的分析

为了揭示龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞 ATP 促进的作用机制，研究了线粒体

的形态和功能，管网状的线粒体网络的形成对于线粒体呼吸、维持其完整性至关重要。应用细

胞渗透性Mito Tracker?Red CMXRos 探针标记活体成纤维细胞和角质形成细胞中的活性线粒

体。染色后，Leica SP8 共聚焦显微镜观察细胞的线粒体形态，捕获线粒体的荧光显微镜图

像。图像中线粒体网络的半自动分析方法如 Valente 等[6]所述，将Image J 软件和线粒体网络分

析工具（Mi NA）结合使用。如图 1所示，原始图像（图 1A）首先通过阈值处理转换为二值图

像（图 1B “），然后利用Skeletonize”将二值图像转换为原始图像的骨架化图像（图 1C），从

而提取细胞线粒体网络的骨架。对骨架进行量化以评估网络结构的丰富程度，每个图像中线粒

体网络的数量用细胞数进行归一化。通过这种方式评估龙血复合物对细胞线粒体完整性的影

响。

图1线粒体网络 Image?J+Mi NA 分析（40X),A.?原始图像；B.?二值图像；C.?骨架化图像

Fig.1 Principle of mitochondrial network analysis by Image J+Mi NA (Magnification

40X),A.Raw image;B.Binnary image;C.Skeletonized image

细胞内的线粒体是以连通的网络形式存在的，为了进一步了解线粒体网络形成的机制，研

究了线粒体融合蛋白-1 (Mitofusin-1，简称 Mfn1）的表达，这种蛋白质是调节线粒体融合和形

态的关键分子之一[10]。与它的同源物 Mitofusin-2 (Mfn2）仅调节或介导特定细胞类型的线粒

文档加载中……请稍候！
如果长时间未打开，您也可以点击刷新试试。

下载文档到电脑，查找使用更方便

免费 4人已下载

立即下载

摘要：

龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞的抗衰老作用来源：日用化学工业作者：蒋丹丹,王风楼,李慧,发布于：2021-08-11共6665字　　摘　　　　要：通过重建老化皮肤细胞的体外评估模型，评估龙血复合物（一种由4种活性成分复合而成的活性物）对正常人皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞ATP含量和线粒体完整性（包括：线粒体形态、线粒体网络和线粒体融合蛋白-1的表达）的影响。ATP检测试剂盒测定成纤维细胞和角质形成细胞内ATP含量，荧光探针染色结合显微镜图像半定量方法评估线粒体形态和线粒体网络结构的丰度，免疫细胞荧光染色方法分析线粒体融合蛋白-1(Mfn1)的表达。实验结果显示，龙血复合物显着促进成纤...

展开>> 收起<<

龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞的抗衰老作用.docx

共7页,预览3页

还剩页未读，继续阅读

龙血复合物对成纤维细胞和角质形成细胞的抗衰老作用

相关推荐

开通VIP享超值会员特权

作者详情

相关内容

推荐作者

热门标签

举报选择: