人OA软骨细胞的分离、消化和培养研究

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人OA 软骨细胞的分离、消化和培养研究

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-08-06 共4743 字

骨关节炎（ osteoarthritis,OA ）是一种随年龄增长而发生率明显增加的退行性关节疾病，其发

病是一个多因素参与的复杂过程[1],至今其病因和发病机理仍不是十分清楚。大量研究表明，

关节软骨的退变被认为是引起 OA 和OA 发展过程中最重要的病理环节[2-3].软骨细胞作为软骨

的唯一细胞成分，其细胞的生物学特性的变化和 OA 的发生发展密切相关[4-6].

软骨细胞体外培养是了解软骨细胞生物学性状和软骨细胞分化、增殖及软骨基质合成过中影响

因素的重要方法，同时也是寻找有效地防治疗 OA 的重要基础。由于 OA 本身存在的病理特征

如软骨的大量磨损和退变，导致体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在较大难度。因而目前

针对骨关节炎的细胞水平的研究，大部分集中在动物关节软骨细胞的体外培养及相关研究领域

[7-9].

然而人骨关节炎是一个多因素的结果，单纯依靠体外的模型获得的 OA 软骨细胞可能并不能真

正意义上替代人的 OA 软骨细胞，从而丧失其研究结果对临床的指导意义。因此，从临床上分

离培养的人 OA 软骨细胞可能是 OA 研究的最佳对象。我们对人 OA 软骨细胞的分离、消化和

培养进行了初步的研究，并对其细胞形态学特点进行了评价，为后期关于人 OA 软骨细胞水平

的相关研究提供实验基础。

1 资料与方法

1. 1 研究对象及样本来源所有标本均取自于四川大学华西医院骨科 10 例晚期骨关节炎行全膝

关节置换患者，取材位置位于股骨内、外髁负重过渡区的关节软骨组织。其中男 3 例,女7 例;

年龄（ 61 . 7 ± 6 . 69 ）岁 ; 体重指数（ 27 . 50 ±1. 28 ）.骨关节炎的诊断标准参照美国风湿病

学会膝骨关节炎诊断标准[10],严格排除免疫性及其他可能影响膝关节病情的合并症，所有患者

术前经全科讨论意见一致。该研究获得医院伦理委员会的批准，所有患者术前均经其本人知情

同意。

1. 2 实验试剂与仪器主要实验试剂：DMEM 低糖培养基、0. 01mol 磷酸盐缓冲液、0. 25% 胰

蛋白酶、L-谷氨酰胺、青- Ⅱ链霉素、型胶原酶、二型胶原抗体、胎牛血清、Cell CountingKit-

8、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、TRIzol、二甲基亚砜、四甲基偶氮唑盐、DAB 显色试剂盒。实

验设备：超净工作台（Heraeus 公司，德国）、水浴摇床（ memmert 公司，德国）、倒置相

差显微镜（olympus 公司，日本）、37℃ 5% CO2 孵育箱（sanyo 公司，日本）、多功能酶标

仪、离心机、电泳仪、微量天平等。

1. 3 软骨细胞获取及培养方法

1. 3. 1 软骨细胞的分离培养膝关节置换术中在无菌条件下显露膝关节软骨组织，以锐利刀片取

OA 患者软骨组织（股骨髁和胫骨平台）, 用生理盐水冲洗 3 次，尖刀片刮除软骨膜后生理盐

水再次冲洗 2 ~ 3 次，放入无菌的装有适量DMEM 低糖培养基（链霉素100 U / mL, 青霉素100

U / mL ）的 50 mL 无菌离心管中立即转送至实验室。采用两步消化法分离关节软骨细胞，将软

骨组织移入无菌培养皿中并用PBS 液冲洗 3 次，仔细将附带的软组织或滑液去除，移入加有少

量培养基的抗生素小瓶内，干净无菌眼科剪机械粉碎至1mm3 以下。之后再将组织块转入另一

50 mL 无菌离心管中，1 000 r / min 低温离心5 min, 随后加入5 倍体积的0. 25% 胰蛋白酶消化

20 min, 弃去上清液，用低糖 DMEM 培养基洗涤 2 ~ 3 次。加入5 倍体积的含0. 2% Ⅱ 型胶原酶

低糖 DMEM 溶液，置 37℃ 水浴箱中轻微振荡消化，一般消化 4 ~ 5 次，每次 25 min,每次消化

后静置5 min 取上清液，移入事先盛有血清及低糖 DMEM 培养基的离心管中终止消化，然后

1400 r/min 离心5 min, 弃去上清液，再用低糖 DMEM 培养基洗涤 2次后待接种，每次如此分时

段收集细胞，以免先消化下来的软骨细胞因消化时间过长活性下降。汇合分时段收集的细胞悬

液，200 目金属滤网过滤细胞悬液（用以除去杂质） , 所得细胞沉淀经吹打后移入含 20% 胎牛

血清的低糖 DMEM 培养基的 25 cm2 培养瓶中，置于 37℃，恒温，5%CO2,饱和湿度培养箱内

培养，隔2 d 换液。

1. 3. 2 传代及鉴定前准备原代培养细胞覆盖瓶底 80% 以上时，吸尽培养基，PBS 液清洗2 ~3

次后加入0. 25% 胰蛋白酶，37℃，5%CO2 孵育箱消化 2 ~ 3 min,待镜下观察大部分细胞变圆漂

浮时，加入20% 含胎牛血清培养基终止消化，并适度拍打培养瓶底以帮助贴壁细胞顺利脱

壁，1 000 r/min, 离心3 min 后加入适量20% 胎牛血清DMEM 培养基重悬，血球计数板计

数，104/ mL Ⅱ传代接种进入传代培养。同时使用血盖片准备进行细胞爬片，型胶原免疫组化

及甲苯胺蓝染色进行细胞形态学的进一步鉴定。

1. 3. 3 软骨细胞爬片的制作和固定每孔收集细胞 8 × 104 个，种植于6 孔细胞培养板（底部放

入血盖片）,37℃，5%CO2 条件下，培养至血盖片上软骨细胞融合率达到 80%; 移除培养基，

以PBS 液冲洗 3 次，每次 1 min; 4%多聚甲醛固定 10 min; 双蒸水冲洗 3 次，将细胞爬片分开；

- 80℃ 长期保存，用时室温自然解冻。

1. 4 检测指标

1. 4. 1 倒置相差显微镜观察在软骨细胞分离培养以及传代培养的各个时期通过倒置相差显微镜

观察 OA 软骨细胞的形态、贴壁生长情况、生长特性及细胞密度，并拍照保存。

1. 4. 2 甲苯胺蓝染色对各代关节软骨细胞用爬片技术，待细胞基本长满后，取出细胞爬

片，PBS 液冲洗 3 次，4% 多聚甲醛室温固定 20 min, 自来水漂洗 15 min, 双蒸水冲洗 3次，放于

染色架上，1% 甲苯胺蓝染色 30 min,双蒸水洗去多余的染液，100%无水乙醇脱水，中性树胶封

片倒置相差显微镜下观察并拍照记录。

1. 4. 3 Ⅱ 型胶原免疫组织化学染色对各代关节软骨细胞用爬片技术，取出细胞爬片，放于染色

架上，滴加正常非免疫动物血清室温下孵育 10 min. 除去血清，滴加1 U 1 000 �Ⅱ兔抗人型胶

原一抗，4℃过夜。PBS 液冲洗 3 次，每次 5 min. 滴加生物素标记的二抗，室温下孵育 10

min,PBS 液冲洗 3 次，每次 5 min.DAB 显色，苏木精复色，无水乙醇脱水，中性树胶封片倒置

相差显微镜下观察并拍照记录。

1. 4. 4 细胞增殖检测取生长良好的第2,4,6 代OA 软骨细胞采用 CCK8 法绘制软骨细胞生长曲

线。在 96 孔板中接种细胞悬液 100μL,7 000 个细胞；每孔加入10μLCCK-8; 将培养板在培养箱

内孵育 2 h; 在460 nm 测定吸光度。

共3 块96 孔板，隔2 d 换液。于第1、3、5、7、9、11 天观察，加入CCK-8 后振荡 5 min 后

酶标仪上测吸光度值，波长为取细胞数的平均值作为结果，然后绘制折线图来描绘细胞的生长

情况。

2 结果

2. 1 细胞培养形态学变化倒置显微镜观察发现，软骨原代细胞呈不均匀分布的多角形或条状，

形态欠规则，似短成纤维细胞样，生长速度偏慢，约13 d 左右可达80%,具有细胞密度依赖

性。培养至第3 代时即已出现长梭形细胞，且生长速度开始下降，4 代后较为明显，至第6 代

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人OA软骨细胞的分离、消化和培养研究来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-08-06共4743字骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种随年龄增长而发生率明显增加的退行性关节疾病，其发病是一个多因素参与的复杂过程[1],至今其病因和发病机理仍不是十分清楚。大量研究表明，关节软骨的退变被认为是引起OA和OA发展过程中最重要的病理环节[2-3].软骨细胞作为软骨的唯一细胞成分，其细胞的生物学特性的变化和OA的发生发展密切相关[4-6].软骨细胞体外培养是了解软骨细胞生物学性状和软骨细胞分化、增殖及软骨基质合成过中影响因素的重要方法，同时也是寻找有效地防治疗OA的重要基础。由于OA本...

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