树突状细胞释放外排体的方式影响间充质干细胞增殖

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树突状细胞释放外排体的方式影响间充质干细

胞增殖

来源：学术堂作者：韩老师

发布于：2014-08-21 共3430 字

外排体(Exosome)是由多种细胞的胞内体衍生而来,通过出芽方式释放到细胞外的一种脂质双层

膜性结构〔1〕,大小为 40~100nm。由于其携带母细胞成分已逐渐被认为是细胞间进行信息交流,

从而产生相互作用的新方式。树突状细胞(DC)作为一种体内分布广泛、最强的抗原提呈细胞,

在成熟的过程中可产生外排体(DCex)。DCex 除表达一些非特异性抗原外, 还表达MHC-Ⅱ 类

分子、CD83、CD86、CD80 等免疫抗原,许多研究证实其具有激活免疫反应、抗肿瘤的作用

〔2〕。近年来,越来越多的研究表明 DCex 也具有诱导免疫耐受的功能〔3〕。因此,由于 DCex 的

免疫调节功能和其本身的稳定性、易获得性,已在肿瘤治疗、诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾

病中引起广泛关注。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种来源于中胚层、成纤维

样贴壁生长的细胞,因其具有多向分化潜能、免疫调节和分泌细胞因子的能力,已成为研究治疗

免疫疾病和组织修复等的重要手段。

MSC 可调节多种免疫细胞的功能,其中 DC 是MSC 免疫调节作用中重要的效应细胞,其重要性已

经在 MSC 应用于造血干细胞移植的临床试验中得到证实。然而,细胞间的调节可能是双向的,在

MSC 影响 DC 成熟及发育的同时,DC 是否也对 MSC 能产生作用,目前尚未见到相关报道。本文

将主要在体外进行探讨 DC 是否可以通过释放DCex 的方式对 MSC 增殖产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人骨髓标本来自于空军总医院血液科健康供者,标本采集经医院伦理委员会要求执行;人淋巴细

胞分离液 Ficoll(1.077g/ml)购于天津灏洋生物制品科技有限公司;α-MEM、RPMI-1640 基础培养

基购自美国 Gibco 公司;胎牛血清(FBS)购自 Hy-clone 公司;重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子

(GM-CSF)、重组人白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)均购于北京新明力泰生物科技

有限公司;脂多糖(LPS)、MTT 购于美国 Sigma 公司;CFSE 染料购于北京碧云天生物科技有限公

司;PE 或FITC 标记的鼠抗人 CD83、CD86、CD80 单抗、Per-cp 标记的HLA-DR 单抗购自于美

国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓 MSC 的分离、培养及鉴定实验室骨髓标本取自骨髓移植健康供者,经知情同意以及

医院伦理委员会批准后采集。细胞分离、培养及鉴定按本实验室常规方法进行〔4-6 〕。将

骨髓液用PBS 以1 U1�的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(Ficoll 液)上,以2

000r/min 离心30min,吸出白膜层细胞,即为单个核细胞。

PBS 洗涤 2次后接种于含10%FBS 的α-MEM 培养液中,经72h 后去除非贴壁细胞,更换新培养

液。以后每 3天更换新鲜培养液。当细胞 80%~90%融合时,胰蛋白酶消化传代。取P3 代细胞进

行流式鉴定和诱导分化功能鉴定,细胞高表达 CD44 和CD73,不表达 CD31 和CD45。此外,细胞

具有体外成脂和成骨分化能力。取第 3~5 代细胞用于实验。

1.2.2 人骨髓来源 DC 的培养及鉴定同上分离得到单个核细胞,按2×106/ml 细胞密度接种于含

10%FBS 的RPMI-1640 培养液中,静置于37℃、5%CO2 孵箱。2h 后去除非贴壁细胞,更换为含

GM-CSF 1 000 U/ml、IL-4 500 U/ml 的培养液。隔天半量换液。第5天加TNF-α1 000U/ml 促进

DC 成熟。48h 后收集细胞进行流式鉴定。

1.2.3 DCex 的制备按 Théry 等〔7〕方法,DC 经LPS(10ng/ml)刺激24h 后收集培养上清,3 500r/min

离心10min 去除细胞大碎片,继续过0.22μm 滤膜以去除更小碎片,将上清液加入超离管中,在

4℃、绝对平衡的条件下超速离心(100 000r/min,1h)后倒掉上清液,PBS 重悬后再次超速离心,收

集DCex。将 DCex 分装后-80℃保存待用。

1.2.4 DCex 电镜观察及表面分子检测吸取 15μl 上述步骤中提取的DCex 悬液,滴于铜网上,静置

2min 后用滤纸慢慢吸干,加20μl 磷钨酸于铜网上负染 2min 后滤纸吸干,PBS 洗涤 1次,白炽灯下

烤20min 后放于电镜下观察。应用乳胶珠子(Beads)结合法检测 DCex 携带抗原。将

0.1μgBeads(105 个左右)加入 1.5 ml 离心管中,MESbuffer 离心洗涤 2次,重悬于MES buffer 中,加

入5μg DCex,室温孵育1h,4℃条件下轻晃孵育过夜。加入甘氨酸封闭液30min 后用3%FBS 离心

洗涤 3次,加入单克隆抗体避光反应 40min,3%FBS 洗涤 2次。应用细胞流式仪进行检测。

1.2.5 MTT 法检测 MSC 增殖将 MSC 重悬于无血清α-MEM 培养基中,按照 5×104/ml 细胞数接种

于96 孔板,每孔总体积为100μl,分别加入为不同浓度的DCex(0、1、2、5、10、15μg/ml),置于

37℃、5%CO2 孵箱分别培养 24、48、72h 后加入 MTT 10μl,37℃孵育4h 后弃去液体,加入二甲

基亚砜 100μl,在490nm 波长下测定吸光度值,分析细胞增殖情况。用不同来源的 MSC 重复实验

3次。

1.2.6 CFSE 标记及流式细胞术验证 MSC 增殖取第 3代MSC,PBS 离心洗涤 2次,加入 CFSE 染料

(1μl/ml),37℃、5%CO2 孵箱中反应 15min,间断摇晃混匀。

PBS 离心洗涤 2次后重悬于无血清的α-MEM 培养基中,按照 5×104/孔接种于 6孔板中,不同浓度

的DCex(0、5、10、15μg/ml),在37℃、5%CO2 孵箱中分别培养 72h 后收集细胞进行流式荧光

检测。利用ModFit 软件分析数据,以获取各组增殖指数(PI)进行比较。用不同来源的 MSC 重复

实验 3次。

1.3 统计学处理

采用 SPSS17.0 软件进行分析。实验数据以��x±s 表示,组间比较采用 one-way ANOVA 和t检

验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC 的形态及表型特征倒置显微镜下观察培养第4天可见聚集成团的细胞,边缘呈毛刺状(图

1a),培养第7天可见细胞散在贴壁生长,胞体较大,可见明显树突状突起,具有 DC 的特殊形态(图

1b),流式检测部分DC 表达 CD86、CD83、CD80、HLA-DR(图2)。【图 1-2.略】

2.2 DCex 的形态及流式鉴定电子显微镜观察到本实验所收获DCex 为圆形或椭圆形的囊性结构,

直径为40~100nm,符合外排体形态特征(图3)。进一步表面抗原分析发现,与来源 DC 相似,DCex

也表达 HLA-DR、CD86 和CD83,部分表达 CD80(图4)。证明所获DCex 来源于 DC。【图 3-4.

略】

2.3 DCex 促进MSC 增殖 MTT 实验结果显示,培养 72h 后不同浓度 DCex 促进MSC 增殖作用

见表 1。与 0μg/mlDCex 组比较,5、10、15μg/ml DCex 组细胞均在48h 出现促增殖作用

(P<0.01)。CFSE 标记及流式检测也证实 DCex 浓度为5、10、15μg/ml 组与 0μg/ml DCex 组比

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摘要：

树突状细胞释放外排体的方式影响间充质干细胞增殖来源：学术堂作者：韩老师发布于：2014-08-21共3430字外排体(Exosome)是由多种细胞的胞内体衍生而来,通过出芽方式释放到细胞外的一种脂质双层膜性结构〔1〕,大小为40~100nm。由于其携带母细胞成分已逐渐被认为是细胞间进行信息交流,从而产生相互作用的新方式。树突状细胞(DC)作为一种体内分布广泛、最强的抗原提呈细胞,在成熟的过程中可产生外排体(DCex)。DCex除表达一些非特异性抗原外,还表达MHC-Ⅱ类分子、CD83、CD86、CD80等免疫抗原,许多研究证实其具有激活免疫反应、抗肿瘤的作用〔2〕。近年来,越来越多的研究表明D...

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