探讨OPG基因与血管平滑肌细胞凋亡的关联性

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探讨 OPG 基因与血管平滑肌细胞凋亡的关联性

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-05-20 共4208 字

血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）对维持动脉壁结构和功能的完整性起到

了重要作用。OPG 作为肿瘤坏死因子受体超家族成员及细胞核因子-κB 受体活化因子配体的诱

导受体，不仅参与了骨的代谢过程，也参与了血管壁的钙化。目前已经有大量研究证实 OPG

与人类心血管疾病之间存在一定的关系。尽管 OPG 在骨代谢过程中的作用已经逐步被阐明，

但其在 VSMC 中的调节作用仍不明确。本研究采用 RNA 干扰技术，构建 OPG 过表达及

OPGRNA 干扰的腺病毒产品，感染 HVSMC，检测各组 VSMC 中OPG 的表达情况以及 VSMC

凋亡情况，从而对 OPG 与VSMC 凋亡之间的关系进行初步探讨。

1 、材料与方法

1.1 材料 HEK293 细胞（美国菌毒种保管中心）。大肠杆菌 DH5α 及腺病毒穿梭载体 pYr-

adshuttle-1，pYr-2.1-hU6OPG 基因（pOTB7-OPG）（长沙赢润生物技术有限公司，中国)。羊

抗人 OPG 多克隆抗体及碱性磷酸酶标记的驴抗羊 IgG（SantaCluz 公司，美国）。MULV 逆转

录试剂盒、限制性核酸内切酶、T4DNA 连接酶、T4DNA 聚合酶等（NewEnglandBiolabs 公

司，美国）。小量质粒提取试剂盒（上海生工公司，中国）。Hoechst33258 染色试剂盒及

AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司，中国）。冻存 HVSMC 细胞由湘雅二医

院内分泌科谢辉博士惠赠。

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增 OPG 基因以 pOTB7-OPG 载体为模板，PCR 扩增 OPG 基因。引物对：OPG-

f：5'-CG GGA TCC GCCACCAT GAA CAA CTT GCT GTG CTG-3'BamHIOPG-

r：5'-GG AAT TCG GCC ATT TCC AGT TAT AAG CA-3'EcoRI。预计扩增片段

大小为 1.2kb,1%琼脂糖凝胶电泳，回收 OPG 条带。

1.2.2 针对 OPG 基因 siRNA 序列的确定和合成通过 Ambion 寻找 OPG 的siRNA 靶点靶序列并设

计对应的寡核苷酸序列，根据 OPG 的基因序列和二级结构，筛选出 3对特异性siRNA，根据

siRNA 设计原则综合考虑，选择第三条靶序列:正义链 5’-GCT CAG TTT GTG GCG

AAT AAA-3’，反义链 5’-TTT ATT CGC CAC AAA CTG AGC-3’，以上述靶序列为

基础，设计 OPG-shRNA 引物。

1.2.3 重组表达质粒的构建及鉴定。分别将 OPG 的PCR 产物及 OPG-shRNA 片段转载至腺病

毒穿梭载体 pYr-adshuttle-1 和pYr-2.1-hU6 上，挑取克隆，用 BamHI、EcoRI 做双酶切鉴定。选

取酶切鉴定正确的克隆送去测序，以进一步确认此质粒为腺病毒骨架载体，并且已经成功插入

OPG 及OPG-shRNA 目的基因。

1.2.4 VSMC 培养及鉴定。冻存 VSMC 复苏后培养于含100ml/L 胎牛血清的培养基中，置于

37℃，50ml/LCO2 细胞培养箱中培养。经平滑肌细胞特异性鼠抗人 α-actin 单克隆抗体免疫组化

鉴定后，证实为 VSMC，实验用4~8 代细胞。

1.2.5 腺病毒感染 VSMC 细胞。将VSMC 分为空白对照组、OPG 过表达组、OPG 过表达

+OPGRNA 干扰组。将VSMC 以1×106 接种于 50ml 的培养瓶中，24h 后用腺病毒感染细胞。孵

育48h 后，消化、离心、收集细胞。

1.2.6 RT-PCR。按常规方法提取总RNA,逆转录成 cDNA。OPG 引物（366bp）:上游引物序列

5’-CCGGAAACAGTGAATCAACT-3’；下游引物序列 5’-CCA CTT TCT TTC CCG

GTA-3’。GAPDH 引物（452bp）：上游引物序列 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC

AC-3’；下游引物序列 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。PCR 循环：

94℃5min,94℃20s,52℃25s,72℃25s，共 30 个循环，72℃末次延伸 3min。取 PCR 产物 9μl,加

1μl 溴酚蓝,1.5%Agrose 凝胶电泳 30min(100V，35mA),紫外灯下观察 DNA 条带,拍照。

1.2.7 Western-blot。参照《分子克隆实验指南》的方法提取细胞总蛋白。考马斯亮蓝定量总蛋

白后，于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。待电泳完毕后 24V 电转印16h 至PVDF 膜，在室

温下封闭 2h。加入鼠抗人 OPG 单克隆抗体，37℃孵育 1h。

二抗为羊抗鼠IgG，37℃孵育 1h，二氨基联苯胺显色，数码照相。

1.2.8 Hoechst33258 染色。将HVSMC 细胞接种于 6孔板，接种密度为1×106 个/孔，24h 后

用腺病毒感染细胞。孵育 48h 后，按Hoechst33258 试剂盒说明书进行染色。

1.2.9 流式细胞术检测。各组细胞培养 48h 后，经 0.2％胰酶处理，离心收集细胞，用 4℃预

冷PBS 洗涤 2次，然后用250μl 缓冲液重悬细胞，调整其浓度为1×106 个/ml。取 100μl 细胞悬

浮于5ml 流式管中，加入 5μlAnnexinV/FITC 和10μl20ug/ml 的碘化丙锭溶液，混匀后室温避光

孵育 15min，然后加缓冲液至 500μl，流式细胞仪分析，获得细胞凋亡数据后用ModFitLT 软件

进行细胞凋亡相对定量分析。

2、结果

2.1 OPG 及OPG-shRNA 重组腺病毒的鉴定。经 BamHI、EcoRI 做双酶切，pAd-OPG 重组质

粒切出约 600bp 的目的条带（见图 1），shRNA 重组质粒切出约 470bp 的目的条带（见图

2），符合预期，说明重组腺病毒 rAd-OPG 及rAd-OPG-shRNA 包装成功。

2.2 RT-PCR 结果。空白细胞组中，OPG 表达量比较弱。OPG 过表达组中，OPG 表达量大大

增加。

在OPG 过表达+OPGRNA 干扰组中，由于 OPG 表达受到抑制，OPG 表达量下降较明显（见图

3）。用分析软件 Phoretix1D 对各条带进行灰度分析，结果显示：与空白细胞组相比，OPG 过

表达组的 OPG 表达量增加；在OPG 过表达+OPGRNA 干扰组中，OPG-shRNA 的干扰率达到

73.9%，有效地抑制了 OPG 基因的表达（见表1）。

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摘要：

探讨OPG基因与血管平滑肌细胞凋亡的关联性来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-05-20共4208字血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）对维持动脉壁结构和功能的完整性起到了重要作用。OPG作为肿瘤坏死因子受体超家族成员及细胞核因子-κB受体活化因子配体的诱导受体，不仅参与了骨的代谢过程，也参与了血管壁的钙化。目前已经有大量研究证实OPG与人类心血管疾病之间存在一定的关系。尽管OPG在骨代谢过程中的作用已经逐步被阐明，但其在VSMC中的调节作用仍不明确。本研究采用RNA干扰技术，构建OPG过表达及OPGRNA干扰的腺病毒产品，感染HVSMC，检测各...

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