外周血CD34+细胞向肝样干细胞转化的探究

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外周血 CD34+细胞向肝样干细胞转化的探究

来源：中国临床新医学作者：韩亚民;殷舞;莫明峥;

发布于：2018-11-15 共6959 字

　摘　　　　　要：目的探讨外周血造血干细胞在体外转化为肝样干细胞的诱导条件。方法选取自

愿行造血干细胞移植符合入选标准患者, 用血细胞分离机采集经粒细胞集落刺激因子

(recombinant human granulocytecolony stimulating factor, G-CSF) +化疗药物动员后患者的外周血

单个核细胞, 通过流式细胞仪及免疫磁珠法筛选出 CD34+的单个核细胞。将 CD34+的单个核细

胞分为对照组、肝细胞生长因子 (hepatic growth factor, HGF) 组、成纤维细胞生长因子 4

(fibroblast growth factor, FGF4) 组、FGF4+HGF 组、HGF+FGF4+ 巨噬细胞集落刺激因子

(macrophage colony stimulating factor, MCSF) 组。动态观察细胞形态学变化, 15 d 后免疫细胞化

学检测 Oct4、ALB、AFP、c-Kit、CK19 及CD34 在各组细胞中的表达。结果

HGF+FGF4+MCSF 组:见大量类圆形细胞, 贴壁生长, 核仁明显, 核质比例大, 部分细胞串珠样生

长; FGF4+HGF 组:见少量类圆形细胞, 余细胞形变明显;对照组、HGF 组、FGF4 组:仅个别细胞

呈类圆形, 大部分死亡。HGF+FGF4+MCSF 组:Oct4、c-Kit、CK19、CD34 阳性表达, AFP 弱阳

性, ALB 阴性; FGF4+HGF 组:细胞 AFP、ALB 阳性表达, CK19、CD34 弱阳性表达, Oct4、c-Kit

阴性;对照组、HGF 组、FGF4 组: 检测指标均无表达。结论经 HGF、FGF4 及MCSF 联合诱导

后的外周血 CD34+单个核细胞更易转化为肝样干细胞。

　关键词：外周血干细胞; 肝样干细胞; 诱导分化;

　 Abstract： Objective To investigate the optimal conditions for the differentiation of peripheral

blood hematopoietic stem cells into hepatic stem cell-like cells in vitro. Methods The patients with

autologous peripheral blood stem cell transplantation in our hospital were selected as the research

objects. The patients' peripheral blood mononuclear cells after the mobilization with rh G-CSF

(recombinant human granulocyte-colony stimulating factor) + chemotherapeutic drugs were collected

by blood cell separator, and the levels of CD34+were detected by flow cytometry, and the CD34+cells

were purified. The CD34+cells were divided into 5 groups: control group, HGF (hepatic growth

factor) group, FGF4 (fibroblast growth factor) group, FGF4 + HGF group and HGF + FGF4 + MCSF

(recombinant human macrophage colony stimulating factor) group. The morphological changes of

cells were observed dynamically.The expressions of Oct4, ALB, AFP, c-Kit, CK19 and CD34 were

detected with immunofluorescence to identify the characters of the differentiated cells after the cells

were cultured for 15 days. Results In the HGF + FGF4 + MCSF group: a large number of round cells,

adherent growth, nucleolus obvious, large proportion of nucleus to cytoplasm, part of the cell bead-

like growth. In the FGF4 + HGF group: a small number of round cells, others deformed significantly.

In the control group, HGF group and FGF4 group: except for individual round cells, most cells died. In

the HGF + FGF4 + MCSF group: positive expressions in Oct4, c-Kit, CK19 and CD34, weak positive

expression in AFP and negative expression in ALB. In the FGF4 + HGF group: positive expressions in

AFP and ALB, weak positive expressions in CK19 and CD34, and negative expressions in Oct4 and c-

Kit. In the control group, HGF group and FGF4 group: all of the above indicators were not expressed.

Conclusion The combination of HGF, FGF4 and MCSF shows obvious advantages in inducing

peripheral blood stem cells to differentiate into hepatic stem cell-like cells.

Keyword： Peripheral blood stem cell; Hepatic stem cell-like cells; Induction differentiation;

肝癌在我国男性发病率、癌性死亡率中均居于第二位, 在肝癌多学科综合治疗中, 肝癌的靶向治

疗载体一直是研究的热点与难点[1,2]。肝样干细胞有向肝癌细胞定向迁移的生物学特性, 被认

为是较好的细胞载体, 可携带目的基因用于肝癌的靶向治疗, 但目前肝样干细胞来源、数量仍是

迫切需要解决的问题[3]。骨髓来源的造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞可在体外特

殊诱导条件下转分化为肝样干细胞[4,5]。此外, 干细胞也越来越多地用于终末期肝病的治疗

[6~8]。本研究拟对外周血 CD34+细胞向肝样干细胞转化的诱导条件、诱导后标记物的表达进

行初步探讨。

1 　、材料与方法

　　 1.1 　、主要试剂与仪器

人造血干细胞培养基 (Gibco 公司, 美国) ;RPMI1640 (Gibco) ; 多聚甲醛 (国药集团, 80096618) ;澳

洲胎牛血清 (Gibco) ; 荧光 (Cy3) 标记羊抗兔 IgG、浓缩型山羊血清购自武汉博士德公

司;DAPI、Triton X-100 购自碧云天生物技术研究所;抗Oct4、c-Kit、AFP、ALB、CK19、CD34

抗体购自 Abcam 公司 (美国) ;rhG-CSF 、巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colony stimulating

factor, MCSF) 购自北京四环生物制药公司; 人淋巴细胞分离液(索莱宝, P8610) ; 荧光显微镜 (奥

林巴斯 BX53 荧光显微镜) 。肝细胞生长因子 (hepatic growth factor, HGF) 、成纤维细胞生长因

子4[fibroblast growth factor, FGF4 (Prospec 公司, 以色列) ]; 环磷酰胺 (江苏恒瑞医药公司) ;替尼

泊苷 (意大利Bristol-Myers Squibb S.r.l) ; 顺铂 (南京制药厂有限公司) ;“The Big Easy”Easy SepTM

Magnet (STEMCELL Technologies, 加拿大) ;CD34+ 细胞免疫磁珠分选试剂盒 (STEMCELL

Technologies, 加拿大) ; 血细胞分离机 (Baxter, 美国) ;BD FACS-Calibur 流式细胞仪 (BD 公司, 美

国) 。

　 1.2 　、外周血来源

外周造血干细胞由非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma, NHL) 患者中自愿行自体外周血造

血干细胞移植者提供[9,10]。经广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准, 血液风湿免疫科协助,

患者病理检查确诊为NHL, 年龄 25~57 岁, 一般状况可, 能耐受放化疗, 患者及家属自愿行自体外

周血造血干细胞移植, 向患者及家属告知临床研究相关操作过程、风险等, 并签署知情同意书,

经CEP (环磷酰胺、替尼泊苷及顺铂) +rhG-CSF 动员, 待外周血白细胞由最低点开始回升至对数

生长时( ≥约5×109/L) 用血细胞分离机连续采集外周血单个核细胞。用流式细胞仪分析测定

CD34+细胞百分比, 并经免疫磁珠筛选技术筛选出 CD34+ 的单个核细胞 (见图1) 。

　 1.3 　、造血干细胞分离

取外周血 3 ml, 加入2 ml RPMI 1640 混匀, 取5 ml 人外周血淋巴细胞分离液加入15 ml 离心管,

将混匀后的外周血平铺到外周血淋巴细胞分离液上, 室温下2 500 r/min 离心25 min, 液体分为 4

层, 最上层为血浆和血小板, 第二层为白膜层, 主要为单个核细胞, 第三层为分离液, 底层为粒细

胞及红细胞层, 取第 2层白膜层, 主要成分为单个核细胞, RPMI1640 洗涤两次备用。

1.4 　、外周血 CD34+细胞纯化

取RPMI 1640 5 ml 重悬分离后的白膜层单个核细胞, 1 000 r/min 离心弃去上清液;用含2%FBS

及1 m M EDTA (292.248 g/mol) 的PBS 制备浓度为5×108 个/ml 的单细胞悬液 5 ml, 放置于14

ml 专用的的聚苯乙烯试管中, 加入500μl 的Easy Sep 正选抗体混合物, 混合均匀, 室温孵育 15

min, 加入250μl 磁珠, 用移液器上下吹打 EasySep 纳米磁珠 10 次, 以确保磁珠悬液混合均匀, 室

温下孵育 10 min, 轻轻上下吹打细胞悬液, 将试管在磁极中放置 10 min, 拿起 EasySep 磁极, 弃去

上清液, 取出磁极中试管, 加入5 ml 含2%FBS 及1mEDTA 的PBS, 再次吹打细胞, 混匀后将试管

重新放回磁极中10 min, 重复最后两步后用 5 ml 含2%FBS 及1 m M EDTA 的PBS 重悬细胞, 1

000 r/min 离心后用造血干细胞专用培养基重悬, 移至37℃、5%CO2 培养箱培养 2 h, 弃掉上清

液, 得到贴壁 CD34+细胞备用。

　 1.5 　、实验分组

外周血 CD34+细胞接种到 12 孔板, 2×106 个/孔, 后将其分为对照组、HGF (20μg/L) 组、FGF4

(20μg/L) 组、FGF4 (20μg/L) +HGF (20μg/L) 组和HGF (20μg/L) +FGF4 (20μg/L) +MCSF

(10μg/L) 组, 于37℃, 5%CO2 培养箱培养, 每2~3 d 换液一次。观察细胞形态, 培养 15 d 进行免

疫荧光检测。

1.6 　、免疫荧光检测

细胞均匀涂布于载玻片上, 4%的多聚甲醛固定, 晾干, 1×PBS 浸洗 3次, 3 min/次, 0.5%Triton X-

100 通透20 min, 1×PBS 浸洗 3次, 3 min/次, 室温晾干, 正常山羊血清室温封闭 30 min, 去除封闭

液, Oct4 (稀释比1 200) ∶、ALB (稀释比1 200) ∶、AFP (稀释比1 100) ∶、c-Kit (稀释比

1 200) ∶、CK19 (稀释比1 200) ∶及CD34 (稀释比1 100) ∶抗体, 4℃孵育过夜, 1×PBS 浸洗 3次,

3 min/次, 室温晾干, 避光荧光 (Cy3) 标记羊抗兔 IgG 37℃孵育 1 h, 1×PBS 浸洗 3次, 3 min/次,

DAPI 避光孵育 5 min, 1×PBS 浸洗 3次, 3 min/次, 室温晾干, 含抗荧光淬灭剂的封片液封片, 荧光

显微镜观察, 拍照。

　 1.7 　、统计学方法

应用SPSS17.0 统计软件进行分析, 计量资料以均数± 标准差(?±s) 表示, 多组间比较采用单因素

方差分析并采用 Dunnett's test 进行组间两两比较, 两组间比较采用 t检验, P<0.05 为差异有统计

学意义。

　　 2 　、结果

　　 2.1 　、动员后 CD34+细胞比例

本研究中 18 例NHL 患者均经病理组织活检及免疫组织化学染色确诊。其中, 男12 例, 女6例;

年龄 25~57 (36.4±6.3) 岁; 单个核细胞为 (2.64~24.17) ×108 个/kg, 平均单个核细胞为 (6.97±1.38)

×108 个/kg, CD34+ 细胞为 (3.98~41.47) ×106 个/kg, 平均CD34+ 细胞为 (6.16±1.03) ×106

个/kg;CD34+ 细胞占有核细胞比例为 (1.73±0.16) %。见图1。

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外周血CD34+细胞向肝样干细胞转化的探究来源：中国临床新医学作者：韩亚民;殷舞;莫明峥;发布于：2018-11-15共6959字　摘　　　　　要：目的探讨外周血造血干细胞在体外转化为肝样干细胞的诱导条件。方法选取自愿行造血干细胞移植符合入选标准患者,用血细胞分离机采集经粒细胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF)+化疗药物动员后患者的外周血单个核细胞,通过流式细胞仪及免疫磁珠法筛选出CD34+的单个核细胞。将CD34+的单个核细胞分为对照组、肝细胞生长因子(hepaticgrowthfactor,HGF...

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