细胞培养论文（专业范文8篇）
细胞培养论文（专业范文 8篇）
来源：中国医药科学 作者：余坤;周永春
发布于：2020-04-23 共12199 字
细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段,该技术作为近年来的研究热点，现已广泛应用于
生物学、医学等多个领域，并且作为新型的药物不断进入临床研究领域，成为某些重大难治性
疾病治疗的新亮点。本文总结了 8 “ ”篇专业 细胞培养论文范文 ，以供参考。
细胞培养论文（专业范文 8篇）之第一篇：基于细胞培养的流感疫苗研究进展
摘要：接种流感疫苗是预防流感最有效的手段。当前广泛使用的依赖于鸡胚的流感疫苗生
产技术难以有效应对不断提高的流感防控需求。使用动物细胞基质代替鸡胚培养进行流感疫苗
生产成为流感疫苗技术创新的重要趋势。近年来,基于不同细胞基质的季节性流感疫苗和大流行
流感疫苗在多个国家和地区获批上市,为流感流行和大流行有效防控提供了重要支撑。本文分别
从细胞基质、疫苗工艺与质量控制以及疫苗临床安全性和免疫原性评价等方面阐述了基于细胞
培养的流感疫苗研究进展,并对细胞基质流感疫苗的应用现状和未来发展进行分析探讨。
关键词：细胞培养,细胞,流感疫苗,质量控制,免疫原性
流感是由流行性感冒病毒( “ ”简称 流感病毒 )引起的一种发病急、传染性强、传播速度快的呼吸
道传染病。据 WHO 统计，每年流感的季节性流行在全球可导致 300 万～500 万例重症病
例、29 万～65 万例死亡病例[1]。时而发生的流感大流行(如2009 年甲型 H1N1 流感大流行)和
人感染 H5N1,H9N2,H7N9,H5N6 等禽流感疫情也给人类健康带来巨大危害和潜在威胁[2]。接种
疫苗是预防流感最有效的手段。70 多年来，基于传统鸡胚培养的流感疫苗在流感防控中发挥了
积极作用，但存在潜在的不足，如疫苗生产依赖于大量符合质量标准的鸡胚有计划供应，疫苗
生产工艺劳动强度较大、难以全面实现自动化，疫苗病毒株较易发生传代适应性变异，鸡胚潜
在致病因子污染与残体无害化处理等问题;特别是在高致病性禽流感流行期间，可能会因鸡胚
供应问题导致疫苗制备原料缺乏，疫苗供应存在极大隐患。以上潜在不足也是限制流感疫苗产
能扩大、质量提升和应急生产能力提高的瓶颈[3,4]。WHO 早在1995 年曾建议流感疫苗生产企
业使用哺乳动物细胞培养来替代鸡胚培养以进行流感疫苗生产[3]。相对于鸡胚培养，基于细胞
培养的流感疫苗的优势主要体现在:摆脱了对鸡胚供应的依赖;工艺易于自动化、规模化;疫苗病
毒株在细胞中传代突变几率低，疫苗抗原性更接近自然流行株;工艺采用相对密闭的生物反应
器系统，可有效降低微生物污染风险;疫苗不含卵清蛋白，可降低接种后过敏反应风险[3,4,5]。
近年来，基于不同类型细胞基质的季节性流感疫苗和大流行流感疫苗已在不同国家和地区获批
上市，为流感流行和大流行的有效防控提供了重要支持(见表 1)。
1 基于不同细胞基质的流感疫苗概况
1.1 基于 MDCK 细胞培养的流感疫苗
犬肾传代细胞(Madin Darby canine kidney,MDCK)是研究人员于1958 年从一只成年雌性cocker
spaniel 犬的肾脏组织中分离获得，该细胞于 1964 年保存于美国典型培养物保藏中心(American
Type Culture Collection,ATCC)，命名为ATCC CCL-34[6]。MDCK 细胞对不同型和亚型流感病
毒株都具有广泛的敏感性，且可以实现病毒的有效扩增，是目前用于流感病毒分离、培养和感
染性滴度检测的主要细胞系。MD-CK 对于流感病毒的广泛适应性也使其成为了基于细胞培养
的流感疫苗研发的重要细胞基质。2001 年，Solvay 公司采用无血清微载体贴壁培养的 MD-CK
细胞研制的三价流感病毒亚单位疫苗(Influvac)在荷兰获得上市批准，但因供应延迟未能正式上
市[5]。2007 年，由 Novartis 公司研制的基于无血清悬浮培养 MDCK 细胞(MDCK-33016PF)的三
价季节性流感亚单位疫苗(Optaflu)获得EMA 的上市许可，该疫苗随后于2012 年12 月正式获得
FDA 批准，并将商品名变更为Flucelvax。2015 年，CSL 公司收购 Novartis 流感疫苗业务
后，Flucelvax 由CSL 公司旗下的Seqirus 公司接管，2016 年5月，Seqirus 的四价流感疫苗获得
美国FDA 批准用于 4岁及4岁以上人群流感预防。2019 年1月，EMA 也正式批准四价
Flucelvax 用于 9岁及以上人群流感预防[6]。此外，韩国SK Chemicals 研发的基于无血清悬浮
培养 MDCK 细胞的三价和四价季节性流感亚单位疫苗也分别于 2014 年和 2015 年获批在韩国上
市[7]。目前Green Cross,Astra Zeneca 等公司开发的基于 MDCK 细胞培养的不同类型流感疫苗
正处于临床试验阶段[8,9]。
1.2 基于 Vero 细胞培养的流感疫苗
非洲绿猴肾(African Green Monkey,Vero)细胞是 1962 年由日本科学家利用正常成年非洲绿猴肾
脏细胞建立[10,11]。Vero 细胞是 WHO 和《中华人民共和国药典》认可的可用于疫苗生产细胞
系，并已用于多种病毒类疫苗的生产。研究表明 Vero 细胞对不同型和亚型的流感病毒也具有
较为广泛的敏感性，但其病毒扩增效率低于MDCK 细胞和鸡胚[10,12]。Baxter 公司利用Vero
细胞微载体无血清培养系统开发的 H5N1 大流行储备疫苗和 09 甲型 H1N1 大流行疫苗
(Celvapan)于2009 年获 EMA 批准上市，基于 Vero 细胞的三价季节性流感病毒裂解疫苗
(Preflucel)分别于 2010 年和 2011 年先后获奥地利和EMA 批准上市，但因接种后疑似预防接种
异常反应增加，EMA 最终对Preflucel 进行了召回处理[3]。
1.3 基于 EB66 细胞培养的流感疫苗
EB66 细胞是法国Valneva 公司的专利细胞系，该细胞是从鸭胚胎干细胞中提取并驯化获得的稳
定传代细胞，EB66 细胞未经化学诱导和遗传修饰，可在无血清培养基或化学成分界定的培养
基中进行全悬浮培养。研究显示 EB66 细胞具有很好的生长特性，细胞倍增时间约为12～14
h，最高细胞密度可达到 3×107 个·m L-1[11,13]。2014 年，由日本化学及血清疗法研究所和
GlaxoSmithKline 合作开发的第一个基于 EB66 细胞的 H5N1 大流行储备流感疫苗在日本获得上
市许可[4]。
1.4 基于 PER.C6 细胞培养的流感疫苗
PER.C6?细胞是荷兰 Crucell 公司专利细胞系，该细胞是将人腺病毒 5型早期基因 E1(Ad5 E1)转
染原代培养的人胚胎成视网膜细胞后获得稳定传代细胞系。PER.C6?细胞可适应于无血清、无
动物源蛋白的培养基，并可在生物反应器中进行全悬浮培养，细胞密度可达到 107 个·m L-1 以
上，接种不同型和亚型的流感病毒进行培养后，细胞上清中病毒感染性滴度可达到 7.6～10
lgTCID50·m L-1，具有较高的扩增效率[11,14]。目前Sanofi Pasteur 开发的基于 PER.C6?细胞的
人用 H7 Ⅰ禽流感疫苗已完成 期临床试验[4]。
1.5 基于其他新型候选细胞系的流感疫苗研究
近年来，研究人员也在尝试开发一些适合流感疫苗生产的新型候选细胞基质。PBS-1 细胞是一
种永生型鸡胚肾细胞，微载体贴壁培养的 PBS-1 细胞对甲型和乙型流感病毒均具有较好的敏感
性，可在不需要 TPCK-胰酶的情况下实现流感病毒野毒株的高滴度扩增，病毒感染性滴度
>6.85 lg TCID50·m L-1[4,11]。AGE1.CR 和AGE1.CR.pIX 细胞分别是转染人 Ad5E1 及E1 和
pIX 基因的鸭传代细胞，无血清悬浮培养的 AGE1.CR 和AGE1.CR.pIX 细胞密度可达到 3.0～
7.7×106 个·m L-1，感染流感病毒 A/PR/8/34(H1N1)后细胞上清流感病毒血凝滴度可达到
2.5lgHAU·100μL-1[4,11]。CAP 细胞系来源于人羊膜细胞，通过转染人 Ad5 E1 和pIX 基因获得
永生化能力，研究表明不同型和亚型的人和动物流感病毒在通过扩增条件优化后，病毒血凝滴
度可高达3.2lgHAU·100μL-1[11,13]。DuckCelt?-T17 细胞系来源于原代鸭胚胎细胞，通过转染
人Ad5 E1A 基因获得永生化能力，Duckcelt?-T17 细胞在无血清悬浮培养条件下细胞密度可达
6.5×106 个·m L-1。通过对近 20 株人、禽流感病毒的细胞感染实验显示，绝大多数流感的感染
性滴度超过 5.8 lgTCID50·m L-1，最高滴度可达9.05 lgTCID50·m L-1，且病毒在感染后24 h 即
可达到最大滴度，这将有望大大缩短工艺时间[13]。最近，ProBioGen 公司报道了其开发的一
株永生型猪肾细胞系PBG.PK2.1，该细胞在化学成分界定培养基中培养最高密度可达到 5×107
个·m L-1，接种流感病毒后的大最血凝滴度达到 3.93lgHAU·100μL-1[15]。以上新型细胞系均具
有成为流感疫苗生产用基质的潜能。
2 基于细胞培养的流感疫苗工艺研究及质量控制
2.1 疫苗工艺研究
基于细胞培养的流感疫苗主要工艺流程包含细胞培养、病毒扩增、病毒灭活和裂解、病毒纯化
和制剂等过程。建立高效的流感病毒扩增系统是基于细胞培养的流感疫苗生产的关键步骤。在
起初的细胞培养工艺研究主要采用含血清培养系统，Hu 等[16]在生物反应器中采用微载体
Cytodex 1、含血清培养基培养 MDCK 细胞(ATCC CCL-34)，细胞最高密度可达到 0.8×107 个·m
L-1，接种 H5N1 流感病毒(A/Vietnam/1194/2004-NIBRG-14)后细胞收获液血凝滴度达到 2.9
lgHAU·100μL-1，病毒感染性滴度达到 8.64～9.22 lgTCID50·m L-1，上清液中HA 含量最高可
达11.74μg·m L-1。有研究者在生物反应器中采用微载体Cytodex 1、含血清培养基培养 Vero 细
胞(ECACC 88020401)并进行了 H1N1 流感病毒(A/PR/8/34)感染实验，细胞上清病毒血凝滴度为
2.6 lgHAU·100μL-1，病毒感染性滴度为 7.83～7.88 lgTCID50·m L-1。
近年来，鉴于动物源性血清的潜在污染风险和成本控制问题以及不断提升的质量监管要求，采
用无血清培养成为流感病毒扩增工艺的主要趋势。有研究者比较了 MDCK 细胞在含血清和无
血清培养体系中流感减毒活疫苗毒株的扩增效率，结果表明在2种培养体系中不同流感病毒株
均能够有效扩增，最高滴度可达到 5.2～7.8 lg TCID50·m L-1，并建立了2 500 L 生物反应器规
模的MDCK 无血清贴壁培养流感病毒工艺。Baxter 在6 000 L 生物反应器中建立了Vero 细胞
(ATCC CCL81)无血清微载体(Cytodex3)培养工艺，细胞密度达到了2.73×106 个·m L-1，接种
A/Vietnam/1203/2004 和A/Indonesia/05/2005 流感病毒后，病毒血凝滴度2.70～
3.01lgHAU·100μL-1、感染性滴度达到 8.6～9.0 lg T-CID50·m L-1，实现了流感病毒的高效扩增
[11]。
无血清悬浮培养由于操作简便、易于放大、成本较低、稳定性高等优势，为流感病毒的大规模
高滴度扩增提供了更加高效和便捷的工艺方案。Huang 等[17]研发了一种适宜于MDCK 悬浮培
养的无血清培养基，细胞密度可达到 5.97×106 个·m L-1,H1N1 病毒感染后血凝滴度可达到 3.88
lgHAU·100μL-1、病毒感染性滴度可达到 10.34 lgTCID50·m L-1，表明无血清悬浮 MDCK 细胞
培养体系用于流感疫苗生产的巨大潜力。Novartis 通过驯化获得1株适应于无血清、无蛋白悬
浮培养适应的细胞株 MD-CK33016-PF，在搅拌槽式反应器实现了 1 000 L 以上规模的培养，并
成功用于该公司季节性流感疫苗和大流行疫苗的生产[5]。目前，利用动物细胞培养进行流感病
毒扩增主要采用批次培养工艺，Bissinger 等[18]设计了一种半灌注培养体系，在该体系中
MDCK 细胞密度可达到 6×107 个·m L-1，累积收获的病毒液血凝滴度为 4.5 lgHAU·100μL-1，
病毒感染滴度可达10 lgTCID50·m L-1，为更高效的流感病毒扩增工艺建立提供了参考。
相对于鸡胚来源的流感疫苗，基于细胞培养的流感疫苗需要相对较复杂的下游工艺流程以去除
宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)和DNA 等非有效成分。一般而言，细胞收获液首先需通过
离心或过滤等方式除去细胞碎片(或微载体)以达到澄清目的。随后再进行病毒灭活处理，甲醛
和β-丙内酯(beta-propiolactone,BPL)是目前广泛使用的 2种化学灭活剂。有研究表明使用 BPL
灭活还有助于将宿主细胞 DNA 片段控制在 300 bp 以下[19]。此外，核酸酶(benzonase)的使用可
有效降低下游工艺过程中的宿主 DNA 含量。细胞培养来源的流感病毒纯化主要利用多步层析
技术进行，纯化工艺开发过程中一般以血凝素(hemagglutinin,HA)回收率、HCP 和DNA 去除率
以及工艺效率等指标进行评估。Kalbfuss 等[20]利用过滤澄清、BPL 灭活、超滤浓缩、分子筛
层析(Sepharose 4 FF)、离子交换层析(Q Sepharose XL)和超滤透析工艺开展了基于 MDCK 细胞
培养的流感病毒纯化工作，结果显示其整体蛋白回收率为52%，宿主 DNA 去除率达到
99.8%，疫苗宿主细胞 DNA 残留为500 ng·剂-1，未达到 WHO 规定的10 ng·剂-1 的标
摘要：
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细胞培养论文（专业范文8篇）来源：中国医药科学作者：余坤;周永春发布于：2020-04-23共12199字细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段,该技术作为近年来的研究热点，现已广泛应用于生物学、医学等多个领域，并且作为新型的药物不断进入临床研究领域，成为某些重大难治性疾病治疗的新亮点。本文总结了8“”篇专业细胞培养论文范文，以供参考。 细胞培养论文（专业范文8篇）之第一篇：基于细胞培养的流感疫苗研究进展 摘要：接种流感疫苗是预防流感最有效的手段。当前广泛使用的依赖于鸡胚的流感疫苗生产技术难以有效应对不断提高的流感防控需求。使用动物细胞基质代替鸡胚培养进行流感疫苗生产成为流感疫苗技术创新...
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作者：闻远设计
分类：其它行业资料
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时间：2024-07-13
