小鼠脊髓微血管周细胞的培养分离及功能评价

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来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-06-16 共4773 字

脊髓微血管周细胞（ spinal cord microvascularpericytes,SCMP ）是血- 脊髓屏障（ blood-spinal

cordbarrier,BSCB ）的重要组成部分，参与调节脊髓微循环血流、内皮细胞紧密连接和 BSCB

的功能。研究表明 SCMP 的功能变化与多种脊髓疾病相关[1].既往关于中枢神经系统周细胞的

体外研究多来源于脑组织，分离策略通常是使用酶消化法获得微血管片段，在血管片段的基础

上分离培养周细胞，但是此策略容易造成杂细胞的污染。而用免疫磁珠分选和流式分选等方法

处理的细胞活性差、产量低，而且成本过高。本研究基于本单位分离脑微血管周细胞的经验

[2], “ ”使用商品化的周细胞培养基，通过培养基筛选法分离小鼠脊髓微血管周细胞，并对所获

得的周细胞的功能进行评价。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物和细胞：清洁级 3 周龄雄性C57BL /6 小鼠[中国医学科学院医学实验动物

研究所，许可证号 SCXK （京） 2009-0007].所有的实验方案已获得中国医学科院微循环研究

实验动物伦理委员会批准。脊髓微血管内皮细胞（ spinal cord mi-crovascular endothelial cells,

SCMECs ）来自本实验室[3].

1. 1. 2 主要试剂：胎牛血清（ FBS ）、改良杜氏伊格尔培养基（ Dulbecco's modified Eagle

medium,DMEM ）（高糖）、II 型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和 1 × PBS、0.

05% 胰蛋白酶和含 10%FBS 的DMEM 培养基（北京协和医学院细胞中心） ; 含10% FBS 的内

皮细胞培养基（ endothelial cell me-dium,ECM ）和含 2% FBS 周细胞培养基（ pericytescell

medium,PCM ）（ Scien Cell 公司） ; 牛血清白蛋白（ BSA ）（ Amresco 公司） ; DNA 酶I（

DNase Ⅰ ）和纤维连接蛋白 Fibronectin （Sigma 公司） ,胶原蛋白酶/ 分散酶（ Roche 公司） ;

抗von Willebrand factor （vWF ）抗体（ Santa Cruz 公司） ; 抗血小板源生长因子受体（

PDGFRβ ）、神经元- 胶质抗原 2 （neuron-gliaantigen 2,NG2 ）抗体、von Willebrand 因子（

von Will-ebrand factor,vWF ）抗体、胶质纤维酸性蛋白（ glialfibrillary acidic protein,GFAP ）抗

体和 α-SMA 抗体（ Abcam 公司） ; FITC 标记和 TRITC 标记的二抗（北京中衫金桥生物技术

有限公司） .APC 标记抗小鼠 CD45 抗体、PE 标记抗小鼠 PDGFRβ / CD140b 抗体、PE / Cy7 标

记抗小鼠 CD31 抗体、FITC 标记抗小鼠 CD11b 抗体及相应的同型对照（ Biolegend 公

司）eFluor? 660 标记抗小鼠 GFAP 抗体及相应的同型对照抗体、流式染色缓冲液（ flow

cytometry stainingbuffer,FCS Buffer ）、细胞内固定工作液（ intracellularfixation buffer,IC

Buffer ）和透化工作液（ permeabili-zation buffer ）（ eBioscience 公司） ; 基质胶（ BD 公

司） ; 活细胞荧光示踪剂 DiI （红色）和 DiO （绿色）（ Life Technologies 公司） .

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞分离与培养：小鼠经 3% 戊巴比妥钠（ 30 mg/kg ）腹腔注射麻醉，断头处死。取出

脊髓组织，用滤纸去除软脊膜，剪碎成约1 mm × 1 mm ×1 mm 大小，整个过程在冰上操作。加

入DMEM Ⅱ 、型胶原蛋白酶（ 1 g/L ）、DNase Ⅰ （15 mg/L ）,37 ℃ 消化 1. 5 h.1 000 × g 离心 8

min,弃上清液，20%BSA-DMEM 重悬； 4 ℃ 1 000 × g 离心 20 min. 弃上清，加入

DMEM、collagenase/dispase （1 g/L ）、DNaseⅠ （6. 7 mg/L ）,37 ℃ 消化 1 h. 加入 DMEM,700

× g 离心 6 min. 弃上清，加入含20% BSA-DMEM 重悬。4 ℃ 1 000 × g 离心 20 min. 弃上清后

DMEM 重悬，悬液内即含微血管片段。将微血管片段用 DMEM 洗2 次，1000 × g 离心 8

min,700 × g 离心 5 min. 弃上清重悬后用细胞滤器过滤。用 ECM 将微血管片段接种至两个

fibronectin （10 mg/L ）包被好的35 mm 培养皿。72 h 后用PBS 清洗3 次，以去除漂浮的死细

胞以及其他杂质，之后继续用ECM 培养。每隔 3 d 换液1 次，自原代细胞从微血管片段爬出

到细胞完全汇合需 7 ~9 d. 待细胞汇合后用胰蛋白酶消化传代 2 次，均使用 ECM 进行培养。从

第3 次传代后，用 PCM 培养。取第 5 代细胞用于细胞鉴定实验（图1 ）.

1. 2. 2 细胞鉴定： 1 ）倒置显微镜观察 SCMP 的形态：用倒置显微镜每隔 24 h 观察细胞从微

血管片段爬出及增殖状况并拍照。2 ）细胞免疫化学方法鉴定：待细胞增殖汇合至 75% 左

右，对细胞进行固定和透化处理。分别加入一抗（ PDGFRβ、NG2、vWF 和GFAP ）（ 1 ∶

200 ）,4 ℃ 孵育过夜； PBS 洗5 min 共3 次；分别加入荧光标记二抗，室温下孵育 1 h,PBS 洗

5 min 共3 次； DAPI 染色 5 min,PBS 清洗；封片。荧光显微镜（DP72,Olympus 公司）下观

察并拍照，用 Image Pro Plus 7. 0 （IPP ）进行定量分析，实验重复3 次。3 ）流式细胞术检测

细胞表面蛋白 PDGFRβ、CD11b 和CD31: 消化并收集细胞，用流式染色工作液将细胞密度调

整为 1 × 1010 个/ L; 取100 μL 加入流式细胞仪测定管，添加 20 μL Fc 受体阻断剂，并孵育 10

min; 添加荧光直接标记的流式抗体和相应的同型对照抗体，4 ℃ 避光孵育 30 min; 流式染色工

作液清洗2 次后，用 PBS 重悬至 100 μL,用细胞筛制成单细胞悬液，行流式细胞仪检测。实验

重复5 次。4 ）流式细胞术检测细胞胞质蛋白 GFAP: 消化并收集细胞，用 FCSB 将细胞密度调

整为 1 ×1010 个/L; 取100 μL 加入流式细胞仪测定管，添加 100 μL 细胞内固定工作液，室温避

光孵育 30 min; 添加 2 mL 透化液，400 × g 室温离心 5 min 后弃上清，用 2 mL 透化液重悬；

400 × g 室温离心 5 min 后弃上清；用100 μL 透化液重悬，加入相应的抗体或相应的同型对照

抗体，室温避光孵育 30 min; 用FCSB 清洗2 次，用 PBS 重悬至 100 μL 后用细胞筛制成单细胞

悬液，行流式细胞仪检测。实验重复5 次。

1. 2. 3 细胞功能评价： 1 ）含 10% FBS 的DMEM 培养基对细胞分化标志蛋白表达的影响：①

两组用 PCM 培养的第5 代细胞，其中一组改用含 10%FBS 的DMEM 培养；另外一组做为对

照组继续用PCM 培养。4 d 后用细胞免疫化学方法和 Westernblot 免疫印记法检测 α-SMA 的表

达。②细胞免疫化学方法鉴定：对细胞进行固定和透化处理。分别加入一抗α-SMA 抗体（

1 200∶ ）,4 ℃ 孵育过夜；PBS 洗5 min 共3 次；加入荧光标记二抗，室温下孵育 1 h,PBS 洗

5 min 共3 次； DAPI 染色 5 min,PBS 清洗；封片油封片。荧光显微镜下观察并拍照，用 Image

Pro Plus 7. 0 （IPP ）进行定量分析，实验重复3次。③Western blot 免疫印记法：将培养至汇

合的细胞收集并裂解。以每孔 40 μg 蛋白上样于10%SDS-PAGE 分离后，将蛋白转移至 PVDF

膜上。用抗小鼠 α-SMA 抗体检测，以β-actin 为内参。实验 1 的比值表示。实验重复3 次。2）

基质胶成管实验：①细胞荧光标记：脊髓微血管内皮细胞用红色荧光素 DiI 标记，SCMP 用绿

色荧光素 DiO 标记。将培养皿中的培养基吸出，加入染色培养基（荧光染料与培养基以1 ∶

200 比例混匀）,放置培养箱内孵育 20 min; 将染色培养基吸出，加入正常培养基清洗3 次（每

次清洗时用正常培养基孵育 10 min 后再将其吸出）.② 以每孔 25 μL 基质胶包被 96 孔板，37

℃30 min 使胶凝固。将SCMECs 和SCMP 以10 1∶ 进行混合后进行接种，每孔接种 5 ×103 个

细胞，ECM 最终体积为 100 μL.24 h 后观察组成管情况。实验重复3 次。

1. 3 统计学分析

数据用均数 ± 标准差（ x ± s ）表示，实验所用数据采用SPSS19. 0 软件处理，组间比较采用单

因素方差分析。

2 结果

2. 1 倒置相差光学显微镜下观察细胞形态

在内皮细胞培养基中，微血管片段呈典型的串珠状或分支状（图2A ）; 48 h 后，可见细胞从

微血管片段中爬出（图2B ）; 4 d 后，细胞逐渐增多，细胞形态多样（图2C ）; 7 ~ 9 d 后细

胞汇合（图2D ）; 细胞传代后（第2 代）继续在ECM 中培养，可见纺锤状的内皮细胞和多

边形的周细胞呈现伴随状增殖（图2E ）; 传代后改用 PCM 培养，长梭状内皮细胞逐渐减少，

多边形、多突起的周细胞呈现优势增殖（图2F ）.

2. 2 SCMP 的细胞免疫化学和流式细胞术鉴定

对第5 代的细胞进行免疫荧光染色鉴定，可见细胞 PDGFRβ 和NG2 双阳性（图3A ~ C）

;vWF （内皮细胞）和 GFAP （星形胶质细胞）阴性（图3D,E ）,表明得到的细胞中没有内

皮细胞和星形胶质细胞的污染。流式细胞仪检测结果显示，PDGFRβ 的阳性率为 95. 52% ± 2.

55% , 而GFAP 为0. 63% ± 0. 26% ,CD31 （内皮细胞）为0. 80% ± 0. 26% ,CD11b （小胶质细

胞）为1. 02% ± 0. 35% （图4 ）.

2. 3 10% FBS-DMEM 培养基促进SCMP 的分化

SCMP 在PCM 中培养 2 ~ 3 d 即可传代。细胞保持典型的多角形形态但是体积较小，且 α-SMA

低表达（图5A ）; 换用DMEM 培养 4 d 后，α-SMA 的表达明显上调（图5B ）,且部分细胞

体积增大，Westernblot 结果（图5C ）表明 α-SMA 的变化情况与细胞免疫化学法检测结果一

致。

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摘要：

小鼠脊髓微血管周细胞的培养分离及功能评价来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-06-16共4773字脊髓微血管周细胞（spinalcordmicrovascularpericytes,SCMP）是血-脊髓屏障（blood-spinalcordbarrier,BSCB）的重要组成部分，参与调节脊髓微循环血流、内皮细胞紧密连接和BSCB的功能。研究表明SCMP的功能变化与多种脊髓疾病相关[1].既往关于中枢神经系统周细胞的体外研究多来源于脑组织，分离策略通常是使用酶消化法获得微血管片段，在血管片段的基础上分离培养周细胞，但是此策略容易造成杂细胞的污染。而用免疫磁珠分选和流式分选等方法处理的细胞...

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