研究HAS-2沉默前后对大肠癌细胞EMT的影响
研究 HAS-2 沉默前后对大肠癌细胞 EMT 的影
响
来源：学术堂 作者：姚老师
发布于：2014-08-29 共3850 字
上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）在胚胎发育、组织发生中起重要作用，
并存在于多种慢性疾病的发病过程及肿瘤的浸润转移过程中。在多数肿瘤的原位、恶性肿瘤细
胞向周围组织侵袭和远处器官转移的过程中均存在 EMT 现象 。
EMT 以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征，伴有多个细胞分子标志改变：上
皮细胞标志物如 E-钙粘蛋白( E-cadherin)、β-连环素（β-catenin）等表达下调；间叶表型标记物
如波形蛋白（Vimenin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin ） 等表达上调；诱导 EMT 的细胞因子和转
录因子如 Snail、Slug、Twist 等表达上调 。
透明质烷合酶 2（hyaluronan synthases-2，HAS-2）是透明质烷（hyaluronan, HA 合成酶之一，
在大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中均有表达。有研究表明，HA
与HAS1-3 与肿瘤的生物学过程密切相关，HAS-2 能够促进乳腺癌等肿瘤 EMT 的发生和发
展 。本实验拟通过 RNAi 干扰技术沉默 HAS-2，研究 HAS-2 沉默前后对大肠癌细胞 EMT 的影
响。
1 、 材料与方法
1.1 材料与试剂
人结直肠癌细胞株 SW620 购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库；siRNA 购自于上海吉玛
基因公司；Lipofectamine LTX and PLUS Reagents、Opti-MEM 培养基、RNA 提取用 Trizol 试剂
购自于 InvitrogenTM 公司；SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、PrimeScript RT reagent
Kit Perfect Real Time 购自于 Takara 公司；兔抗人 E-Cadhrein、Vimentin、Slug 抗体购自于 CST
公司；小鼠抗人 HAS-2 抗体购自于 Santa Cruz 公司；小鼠抗人 GAPDH 抗体及辣根酶标记山羊
抗兔 IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG 二抗购自于北京中杉金桥公司。
1.2 细胞培养与转染
人结直肠癌细胞株 SW620 用含 10%胎牛血清的 L-15 培养基，于 37℃无CO 培养箱中培养传
代，每 22 天换液 1次，每 3天传代 1次。取生长状态良好的细 5胞用于实验。转染前 1天将
2.5×10 对数期生长的细胞接种于 6孔板，使细胞达到 60~70%汇合。转染前 1h 用不含新鲜胎牛
血清（FBS）的 L-15 培养基饥饿细胞 1h。将细胞分为未转染组、转染 negative controlsiRNA 的
阴性对照组及转染 HAS-2 siRNA 的实验组,转染 4-6h 后更换含 10%FBS 的L-15 培养基。
1.3 流式细胞仪检测转染效率
将带 FAM 荧光标记的阴性对照 siRNA 与LipofectamineLTX and PLUS Reagent 按1：
1、1:2、2:1 的比例进行转染，转染后 24h 用0.25%胰酶消化细胞，1000 转/分离心机离心
5min ，PBS 洗涤沉淀3次后用 PBS 吹悬细胞沉淀，用流式细胞液检测转染效率，转染效率最
高组用于以后实验。
1.4 Realtime PCR 检测干扰效率
按转染效率最高组进行转染，转染后 24h 后按 RNAiso Reagent 试剂说明书提取细胞总RNA，
用TMPrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒进行逆转录获得 cDNA，反应总体
系为10μl 样品总 RNA≤500ng 体系如下： 5×Prime Script Buffer2μl, PrimeScriptTM RT Enzyme
Mix 0.5μl, Random 6mers 0.5 l, Oligo dT Primer 0.5 l。反应条件：37℃15min, 85℃ 5s。以看家基
因β-actin 为内对照，通过相对荧光定量 PCR 方法应用Mx3000P 定量 PCR 仪对 HAS-2 进行检
测, 计算出各组HAS-2 的相对表达量，引物序列：Has-2 上游引物：5' -
CAGCCTCATCTGTGGAGATGGTAA-3'，下游引物：5' -
摘要：
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研究HAS-2沉默前后对大肠癌细胞EMT的影响来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-29共3850字上皮间质转化（epithelialmesenchymaltransition,EMT）在胚胎发育、组织发生中起重要作用，并存在于多种慢性疾病的发病过程及肿瘤的浸润转移过程中。在多数肿瘤的原位、恶性肿瘤细胞向周围组织侵袭和远处器官转移的过程中均存在EMT现象。EMT以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征，伴有多个细胞分子标志改变：上皮细胞标志物如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、β-连环素（β-catenin）等表达下调；间叶表型标记物如波形蛋白（Vimenin）、N-钙粘蛋...
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