质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散的影响
质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散
的影响
双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定 DNA 重组成功与否的重要方法[1],琼脂糖凝胶电泳图像质量
直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将
其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作[2],而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者
在双酶切鉴定葡萄糖 6 - 磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydro-genase,G6PD ）重组质粒
pET-28a-G6PD 时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响，现报道如
下，以供参考。
1 材料与方法
1. 1 质粒与菌株
含空质粒 pET-28a 的大肠杆菌 Top10 （pET-28a / Top10 ）由本教研室保存。重组质粒 pET-28a-
G6PD 为笔者构建并转化至 Top10 感受态细胞中。
1. 2 试剂与仪器
质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、50 × TAE 电泳缓冲液购自上海生工生物工程有限公司，快速
限制性核酸内切酶为 Fermentas 公司产品，琼脂糖为 Biowest 公司产品。酵母浸出粉、胰蛋白
胨为 OXIOD 公司产品。MilliQ 超纯水为 实 验 室 自 制。DNAmarker 为TAKARA 公司产
品。POWER Pac HC 高电流电源为 BIO-RAD 公司产品、GIS 凝胶成像仪为上海天能公司产
品，DYCP-31DN 型电泳槽为北京六一仪器厂产品。
1. 3 菌液培养
将含 pET-28a 和pET-28a-G6PD 的大肠杆菌 Top10 分别划线于含 100 μg / ml 卡那霉素的 LB 平
板中，37 ℃ 倒置培养 15 h. 挑单菌落各 1 个，接种至 40 ml （装于 250 ml 三角瓶中）含 50 μg/ml
卡那霉素的 LB 中，于摇床内 37 ℃ 250 r/min 培养，用上述不含菌液的 LB 作为空白对照，用
可见分光光度计测定 600 nm 处的菌液的光密度值（OD600），至 OD600 为1. 6,停止培养。
1. 4 取
1. 4 ml 菌液抽提质粒
利用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。步骤如下：①分别从各瓶吸取菌液 1. 4 ml 至1. 5 ml 管心
管，室温 10 000 r/min, 离心 30 s, 弃上清；②加 250μl 溶液 P1,3 000 r/min 涡旋 1 min;③ 加250 μl
溶液 P2, 温和颠倒混匀 10 次，室温静置 4 min;④加入 350 μl 溶液 P3, 温和颠倒混匀 10 次；⑤室
温12 000r / min 离心 6 min;⑥ 取750 μl 上清于另一 1. 5 ml 离心管，室温 14 000 r/min 离心 10
min;⑦取600 μl 上清于吸附柱中，室温 9 000 r/min 离心 30 s;⑧弃滤液，向吸附柱中加 500μl
WD1,室温 10 000 r/min 离心 1 min;⑨ 弃滤液，向吸附柱中加 500 μl wash buff-er, 室温 10 000 r /
min 离心 1 min;⑩重复⑨一次；����? 弃滤液，将吸附柱置于收集管中，室温 13 000 r/min
离心 2 min; ?���� 将去盖的吸附柱置于灭菌的 1. 5 ml 离心管，做好标记，向吸附柱中加入
80μl 灭菌超纯水，室温静置 2 min,13 000 r/min 离心 1 min,收集滤液，冰浴备用。
1. 5 取2 × 0. 7 ml 菌液抽提质粒
分别从各瓶取菌液 0. 7 ml 至1. 5 ml 离心管，平行抽提两份，按1. 4 - ① ⑥ 抽提质粒，将⑥后的
两份平行抽提的上清各 600 μl 收集于1. 5 ml 离心管，于同一吸附柱内分两次进行⑦，后续步骤
与1. 4 相同。
1. 6 取4 × 0. 35 ml 菌液抽提质粒
摘要：
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质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散的影响双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定DNA重组成功与否的重要方法[1],琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作[2],而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose6-phosphatedehydro-genase,G6PD）重组质粒pET-28a-G6PD时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响，现报道如下，以供参考。1材料与方法1.1质粒与菌株含空质粒pET-28a的大肠杆菌Top10（p...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
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时间：2024-04-23
