沼水蛙抗菌多肽brevinin-2GHa1的分离提纯及其结构研究
沼水蛙抗菌多肽 brevinin-2GHa1 的分离提纯
及其结构研究
在自然环境下，两栖动物受到紫外线、病原微生物的伤害及捕食者的威胁． 面对恶劣的自然环
境，两栖动物体表进化出许多特殊的腺体，这些腺体能够分泌丰富多样的生物活性肽，如抗氧
化肽、抗菌肽、抗病毒多肽等，其中的抗菌肽研究已取得诸多进展． 有研究者仅从 Odorrana
grahami 中就发现了 107 种新型的抗菌肽． 目前已经发现的两栖动物抗菌肽已有上千种，研究
者根据沼水蛙抗菌肽的氨基酸序列，将其分成 brevinin、esculentin、nigrocin 和odorranain 等不
同家族． 多种抗菌肽相互配合，快速有效地消灭病原微生物，成为两栖动物生存繁衍的有效保
障之一．沼水蛙学名 Hylarana guentheri ，广泛分布于中国南部和一些东南亚国家． 沼水蛙皮肤
能够分泌多种抗菌肽． 目前，已从沼水蛙皮肤分泌物中获得分别属于 brevinin、temporin 和
guentherin 家族的 9 种抗菌肽． 在不同的生活环境下，两栖动物会分泌不同的抗菌肽来适应新
的环境，沼水蛙抗菌肽的开发利用需要更多研究． 本文通过电刺激法获取沼水蛙皮肤分泌物，
利用凝胶过滤色谱和高效液相色谱进行分离纯化，获得了 1 种新的抗菌多肽 brevinin-2GHa1，
并对其抗菌活性和溶液结构进行了研究．
1 材料与方法
1. 1 材料
野生成年沼水蛙捕捉于福建省福清，数量 n =18 ，体长 80 ～90 mm; 三氟乙酸( trifluoroacetic
acid，TFA) 、三氟乙醇 ( trifluoroethanol，TFE) ，购于德国 CNW Technologies GmbH 公司;
Sephadex G-50 凝胶过滤色谱填料购于美国 GE 公司; 甲醇和乙腈( 高效液相色谱纯) 购于德国默
克公司; 其它试剂均为国产分析纯．LC-20A 岛津高效液相色谱，Gemini 5 μ C18 反相高效液相
色谱柱( 250 mm ×4. 6 mm) ，J-810 圆二色谱仪，XZ-21K 型高速冷冻离心机，FD-1C-50 冷冻干
燥机，752 型紫外可见分光光度计，TSQ-280 培养箱，BS-160A 自动部分收集器，BT01-100 蠕
动泵驱动器，MILLI-Q 型超纯水机．
1. 2 沼水蛙皮肤分泌物抗菌肽的分离纯化
提取沼水蛙皮肤分泌物: 电刺激法稍作修改． 市售 10 V 直流电池适度刺激沼水蛙耳后及背部腺
体发达的部分皮肤，间隔 5 s 刺激 1 次，每次持续 1 s ． 待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，
采用0. 05% ( V/V) 三氟乙酸酸化，去离子水冲洗，收集冲洗液，离心 12 000 r/min，10 min，
取上清液，置于-80℃冰箱迅速冷冻后做冷冻干燥处理，保存于-20℃备用．Sephadex G-50 凝胶
过滤色谱: 去离子水溶解沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，12 000 r/min 离心 10 min ．取上清液用 0. 22
μm 孔径的微滤膜过滤． 滤液上样用 0. 5% ( V/V) 的三氟乙酸水溶液平衡的SephadexG-50 凝胶
柱( 1. 6 cm × 100 cm) 分离． 洗脱液为 0. 5%( V/V) 的三氟乙酸水溶液，流速 0. 3 mL/min，每 10
min 收集 1 管洗脱液，于 214 nm 波长检测吸光值． 收集洗脱峰，冷冻干燥． 滤纸片法测定其
抗菌活性，对有活性的组分进一步分离纯化．反相高效液相色谱: 去离子水重新溶解具有抗菌
活力冻干组分，离心 12 000 r/min，10 min ，收集上清液，经 0. 22 μm 滤膜过滤并上样至反相
高效液相色谱． 液相色谱系统为LC-20A ，装配Gemini 5 μC18( 250 mm × 10 mm) 反相柱
( Phenomenex，UK) ．以含 0. 05% ( V/V) 三氟乙酸的乙腈水溶液为流动相，进 行 梯度洗 脱，
检测波长214 nm ，流 速 为 1. 0 mL / min ，洗脱时间40 min ．洗脱梯度为: 0 ～5 min，20% 乙
腈水溶液; 5 ～40 min，20%→70% 乙腈水溶液． 收集具有抗菌活性的峰，冷冻干燥后于-20℃
保存备用．
1. 3 抗菌活性的测定
纸片法测定跟踪样品的抑菌活力: 所用菌种为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌． 具体操作如下: 挑
取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养( 37℃，130 r/min) ． 取 200 μL 过
夜培养物接种于 20 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养 4 h ( 37℃，130 r/min) 获得菌悬
液． 将菌悬液稀 释 1 000 倍作 为 测 定 活性用菌液．取100 μL 加入倒置的平板表面，涂
布均匀，在平板表面贴直径5 mm 的滤纸片，滤纸片上加10 μL 待测样品，浓度为 5 mg/mL ．
庆大霉素作为阳性对照，无菌水作阴性对照． 将平板倒置于37℃ 恒温培养 18 ～20 h 观察结
果．最小抑菌浓度测定: 采用微量稀释法测定样品最小抑菌浓度( minimal inhibitory
concentration，MIC，定义为显着抑制细菌生长的最低浓度) ． 实验所用菌种为大肠杆菌、枯草
芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌( 上述菌种均为本室保存) ．菌种复苏，接种斜面37℃
培养过夜，挑单菌落接种于普通LB( Luria-Bertani) 培养基中，37℃ 培养过夜，稀释菌液使菌
浓度为 1 × 104 ～1 × 105CFU /mL 备用． 将抗菌肽溶液按2 倍浓度稀释，每孔抗菌肽体积为
100 μL ，加入 100 μL 稀释好的菌悬液混匀，使每孔抗菌肽的终浓度分别为 2. 0，3. 9，7.
8，15. 6，31. 3，62. 5，125，250 μg / mL ． 将 96 孔板置于37℃ 过夜培养，酶标仪检测 630
nm 波长的吸光值．当含有抗菌肽的培养液细菌生长浓度( A630) 与对照组培养液细菌生长浓度(
A630) 比值小于10% 时，认定抗菌肽在该浓度下对细菌有抑制作用． 能够抑制细菌生长的最
小浓度即为MIC．
1. 4 沼水蛙抗菌肽一级结构测定
Edman 降解法是多肽和蛋白质测序中最可靠的方法之一． 根据埃德曼降解法原理，通过自动
蛋白/ 多肽测序仪 ( 岛津，PPSQ-33A) 测定抗菌肽一级结构．
1. 5 沼水蛙抗菌肽溶液结构研究
在室温下，用 J-810 圆二色谱仪测定样品在不同溶液中远紫外区的结构特征． 样品池光径1
mm ，扫描速度为 500 nm/min ，扫描范围为190 ～260 nm ，扫描狭缝宽度为 4 nm ，连续扫描 3
次取平均值，除去样品以外的相同溶液作为背景扣除． 试验中样品的终浓度均为 300 μg/mL．
测定溶液对结构的影响: 采用去离子水、SDS 水溶液( 10 mmol/L) 和TFE( 100%) 为溶剂，测定
样品在不同溶液体系的圆二色谱特征．测定 TFE 浓度对结构的影响: 采用不同浓度TFE /
H2O( 5% ，10% ，20% ，30% ，50% ，100% ，V / V) 溶液配制样品，测定样品溶液在不同
TFE 浓度下的二级结构变化．
2 结果
2. 1 凝胶过滤色谱纯化
将沼水蛙皮肤分泌物冷冻干燥后重新溶解，采用Sephadex G-50 凝胶过滤色谱分离． 测定洗脱
液214 nm 波长吸光值，绘制洗脱曲线． 如 Fig ．1 所示，沼水蛙皮肤分泌物经凝胶过滤色谱
获得初步分离，获得 2 个组分F1 和F2 ．平板涂布法检测组分F1 和F2 对金黄色葡萄球菌和大
肠杆菌的抑制作用． 添加 F1 滤纸片周围有明显抑菌圈，表明F1 对金黄色葡萄球菌( Fig ．2A)
和大肠杆菌( Fig ．2B) 均有抑制作用，而添加 F2 滤纸片则未见抑菌圈，表明组分F2 对大肠杆
菌和金黄色葡萄球菌均无抑制作用． 故收集组分F1 进一步分离纯化．
2. 2 反相高效液相色谱纯化
用RP-HPLC 分离具有抗菌活力的F1 ，收集了 6个组分( Fig．3) ，通过抗菌活性测定，发现峰
1 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用． 采用分析型 C18 RP-HPLC 柱鉴定其纯度，峰1
具有较高的纯度，因此选取洗脱峰峰 1 进行序列测定．
2. 3 抗菌肽结构分析
用氨基酸自动分析仪测定其一级结构，获得序列: Gly-Phe-Ser-Ser-Leu-Phe-Lys-Ala-Gly-Ala-
Lys-Tyr-Phe-Leu-Lys-Gln-Val-Gly-Lys-Ala-Gly-Ala-Gln-Gln-Leu-Ala-Cys-Lys-Ala-Ala-Asn-Asn-
Cys ． 将 该氨基酸序列与数据库( http: / /www ．ncbi ．nlm ．nih ．gov/BLAST) 中收录的抗菌
肽序列进行比对，未发现相同序列，该抗菌肽为新型抗菌肽． 其序列和已知的brevinin-2GHa
序列高度相似( Fig ．4) ，属于 brevinin-2 家族，将其命名为 brevinin-2GHa1 ． 同 brevinin-2GHa
相比，brevinin-2GHa1 的C 末端少了1 个丙氨酸( Ala) ，且第 13 位的苯丙氨酸( Phe) 和第16 位
的谷氨酰胺( Gln) 分别取代了brevinin-2GHa 的亮氨酸( Leu) 和丝氨酸( Ser) ．为进一步研究
brevinin-2GHa1 结构特征，用蛋白质分析网络服务器NPS @ ( http: / /npsa-pbil．ibcp ．fr / cgi-
bin / npsa _ automat ．pl? page = / NPSA /npsa_seccons ．html) 在线预测其二级结构． 该抗菌肽
的C 末端 2 个半胱氨酸形成二硫键，因此，截取brevinin-2GHa1 的Gly1-Ala26 部分进行预
测．预测采用King 等提供的方法，经过服务器分析，brevinin-2GHa 和brevinin-2GHa1 在Ser3-
Ala26 部分都形成了 α-螺旋结构( Fig ．4) ．根据 α-螺旋的结构特征，将该部分结构绘制成轮状
图( Fig ．5) ．由轮状图可知，brevinin-2GHa1 的疏水氨基酸和亲水氨基酸分别聚集于螺旋结构
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沼水蛙抗菌多肽brevinin-2GHa1的分离提纯及其结构研究在自然环境下，两栖动物受到紫外线、病原微生物的伤害及捕食者的威胁．面对恶劣的自然环境，两栖动物体表进化出许多特殊的腺体，这些腺体能够分泌丰富多样的生物活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、抗病毒多肽等，其中的抗菌肽研究已取得诸多进展．有研究者仅从Odorranagrahami中就发现了107种新型的抗菌肽．目前已经发现的两栖动物抗菌肽已有上千种，研究者根据沼水蛙抗菌肽的氨基酸序列，将其分成brevinin、esculentin、nigrocin和odorranain等不同家族．多种抗菌肽相互配合，快速有效地消灭病原微生物，成为两栖动物生存繁...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
价格：免费
属性：4 页
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格式：DOCX
时间：2024-04-23
