增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法研究

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增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法研究

黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD），属黄素蛋白酶类，可将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继

续氧化黄嘌呤为尿酸，并产生过氧化氢及超氧化物，是嘌呤代谢的关建酶。可用于检测血清无

机磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黄嘌呤、次黄嘌呤水平。

在核苷类药物的合成中起到促进转化的作用，可用于提高 5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成产

量。不同生物来源的黄嘌呤氧化酶酶学性质具有差异性。来源于细菌的黄嘌呤氧化酶国内外研

究较少，已报道黄嘌呤氧化酶的相对分子质量及亚基组成差异较大，蛋白结构组成的差异将导

致酶催化性能及稳定性的不同。

黄嘌呤氧化酶作为一种重要的氧化酶，其在医学诊断及工业催化中有应用前景，酶较差的稳定

性影响其直接应用。已报道的提高酶稳定性的方法主要有添加保护剂、蛋白质工程、固定化方

法等。其中，固定化方法因具有可连续反应性、可重复利用性等优点，备受关注。可使用的

固定化载体主要有聚丙烯酰胺、壳聚糖、醋酸纤维素薄膜、树脂等。国内外关于黄嘌呤氧化酶

稳定性研究，主要集中于改进溶液环境提高酶热稳定性，对其固定化研究相对较少。

前期经SDS -PAGE 电泳分析知，节杆菌Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶含两个亚基，相

对分子质量约为 100 000 及35 000 ，与已报道的黄嘌呤氧化酶均不相同。在此基础上，作者

对此黄嘌呤氧化酶的酶学性质进一步分析，并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固

定化黄嘌呤氧化酶。提供有效增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法，也为其它酶类的稳定性

研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

Arthrobacter M3 ：作者所在实验室保藏菌种。

1.2 主要材料

黄嘌呤氧化酶标准品（相对分子质量 160 000）：近岸蛋白质科技有限公司提供；大孔阴离子

交换树脂（D201、201×4 ），浙江争光实业股份有限公司提供；Sepharose 4B ：通用电气医疗

中国有限公司提供；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDC）：梯希爱（上海）化成工业发展有

限公司提供。

1.3 主要仪器

V1100D 可见分光光度计：美谱达仪器有限公司产品；电热恒温水浴锅：科辉仪器厂产品；蛋

白电泳仪：美国 BIO-RAD 公司产品；pH 计（PB-10 型）：德国赛多利斯股份有限公司产品。

1.4 培养及纯化方法

从固体平板挑取单菌落，接入种子培养液，30 ℃ 恒温振荡培养 12 h 。后将种子培养液按体积

分数3% 接种量接入60 mL （500 mL 锥形瓶）发酵培养基，30 ℃、220 r/min 培养 20 h 。菌液

破壁离心后，取上清酶液进行纯化，参考文献[17] 。纯化后酶液经 0.22 μm 滤膜过滤，置于4

℃ 保存备用。

1.5 XOD 酶活测定方法

黄嘌呤氧化酶酶活测定方法详见参考文献。酶活力单位定义：在 37 ℃ 下，每分钟形成1 μmol

过氧化氢所需的酶量定义为1 个酶活单位（U ）。

1.6 XOD 酶学性质分析

1.6.1 凝胶过滤确定XOD 相对分子质量以商业化的黄嘌呤氧化酶（相对分子质量 160 000）标

准品为对照，利用安捷伦 SEC-5（7.5 mm×300 mm，5 μm ）凝胶过滤柱测定 XOD 相对分子质

量。测定条件：流动相0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0 ），流量0.5mL/min ，进样量40

μL ，检测波长 280 nm 。

1.6.2 酶的最适反应温度及最适反应 pH 取一定浓度的稀释酶液，于 25~52 ℃水浴条件下进行酶

活力测定，以活力最高者为 100% ，计算不同温度下相对酶活。另取一定浓度的稀释酶液，于

37 ℃、不同 pH 条件下（5.5~9.0 ）进行酶活力测定，以活力最高者为 100% ，计算不同

pH 条件下相对酶活。

1.6.3 金属离子对酶活的影响在 pH 7.5 酶液中加入不同金属离子

（Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Hg2+ ），至终浓度为 2 mmol/L，

混匀，测定各组酶活，以未加金属离子的酶液酶活为 100% ，计算各组相对酶活。

1.7 XOD 固定化方法比较

1.7.1 大孔阴离子交换树脂固定化分别称取已预处理的201×4 阴离子交换树脂及 D201 大孔阴

离子交换树脂各1.0 g 于10 mL 离心管中，加入pH7.5 的酶液 6 mL，4 ℃、100 r/min 下振荡固

定化 2 h 。

混合物 8 000 g 离心5 min ，测定上清酶活。后用20mmol/L 磷酸盐缓冲液洗涤至无酶析出，测

定洗涤液酶活性及固定化酶活力，计算固定化酶载量及酶活回收率。

将固定化的黄嘌呤氧化酶，置于50 ℃恒温水浴，2 h 后测定酶活力，各组以未加热处理的固定

化酶酶活为 100% ，计算各组固定化酶的相对酶活。

1.7.2 琼脂糖介质的修饰及其固定化参考文献方法，分别先将间隔臂甘氨酸、谷氨酸、天冬氨

酸交联于预处理的琼脂糖介质上，3 种修饰后的介质分别命名为琼脂糖- 甘氨酸介质

（Sepharose-Gly）、琼脂糖-谷氨酸介质（Sepharose-Glu）、琼脂糖-天冬氨酸介质（Sepharose-

Asp ）。称取不同的羧基载体各1.0 g 于10 mL 离心管中，添加酶液，调节pH 至6.5 ，加入

EDC 共价交联固定化黄嘌呤氧化酶，4 ℃ 振荡固定 15 h ，混合物 8 000 g 离心5 min，测定上清

酶活。后用0.6 mol/L 氯化钠洗脱非共价交联的酶，至洗脱液无酶析出，再用20 mmol/L 磷酸

盐缓冲液洗涤，测定洗脱液、洗涤液酶活性及固定化酶活力，计算固定化酶载量及酶活回收

率。将各修饰的琼脂糖固定化酶置于50 ℃恒温水浴，2 h 后测定酶活力，各组以未加热处理的

固定化酶酶活为 100% ，计算各组固定化酶的相对酶活。

1.8 固定化化酶与游离酶热稳定性的比较

1.8.1 不同温度下固定化酶与游离酶热稳定性比较将游离酶与固定化酶置于20 mmol/L 磷酸盐

缓冲液（pH 7.5）中，不同温度下（25、35、45、55、65、75℃ ）保温1 h ，冷却至 4 ℃，测定

各组酶活。以各组未做处理酶的酶活为 100% ，计算相对酶活。

1.8.2 固定化酶与游离酶最适稳定 pH 的比较将酶液于不同 pH 条件下（5.5~8.5），50 ℃ 保温1

h ，冷却至 4 ℃ ，测定各组酶活，各组以0 h 时酶活为 100% ，计算相对酶活。

1.8.3 固定化酶与游离酶存储稳定性的比较将固定化酶与游离酶置于20 mmol/L Tris-HCl 缓

冲液（pH 7.5 ）中，置于50 ℃恒温水浴，定时取样，冷却至 4 ℃，测定固定化酶与游离酶酶活

力，各组以0 h 时酶酶活为 100% ，计算各组不同时间处相对酶活。

2 结果与讨论

2.1 XOD 酶学性质分析

2.1.1 XOD 相对分子量的确定由前期研究 SDS-PAGE 电泳测得，菌种 Arthrobacter M3 产的黄

嘌呤氧化酶含两个亚基，相对分子质量分别约为 100000 及35 000 。由图 1 凝胶过滤图谱知，

黄嘌呤氧化酶标准品（相对分子质量 160 000 ）凝胶过滤出峰时间为11.64 min，Arthrobacter

M3 黄嘌呤氧化酶出峰时间则为11.98 min，即比黄嘌呤氧化酶标准品相对分子质量略小。综合

判定，节杆菌 Arthrobacter M3 黄嘌呤氧化酶为相对分子质量约 135 000 的异质二聚体蛋白。

2.1.2 XOD 的最适反应温度及最适反应 pH 温度是影响酶反应效率的重要因素之一，一定范围

内提高反应温度可加快反应速率。在 25~52 ℃ 范围内进行酶活力测定，结果见图2 。由图 2

可知，37 ℃ 时测得XOD 酶活力最高。在不同 pH 值下进行酶酶活力测定，结果见图3 。该酶

最适反应 pH 为7.5 ，溶液 pH<5.5 或pH>9.0 时对酶活力测定影响较大。

2.1.3 金属离子对酶活的影响如表 1 所示，不同金属离子对 XOD 酶活影响具有差异性。 Mn2

+对XOD 活性具有激活作用，相对酶活提高 35.6%，Co2+ 及Zn2+ 对XOD 酶活具有一定抑制

作用，相对酶活分别降低 21.1% 和67.8%，Cu2+、Ag+、Hg2+ 对XOD 酶活具有致死作用，这

可能是由于3 种金属离子作用于蛋白巯基，导致 XOD 变性失活。

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摘要：

增强黄嘌呤氧化酶稳定性的固定化方法研究黄嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XOD），属黄素蛋白酶类，可将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继续氧化黄嘌呤为尿酸，并产生过氧化氢及超氧化物，是嘌呤代谢的关建酶。可用于检测血清无机磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黄嘌呤、次黄嘌呤水平。在核苷类药物的合成中起到促进转化的作用，可用于提高5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成产量。不同生物来源的黄嘌呤氧化酶酶学性质具有差异性。来源于细菌的黄嘌呤氧化酶国内外研究较少，已报道黄嘌呤氧化酶的相对分子质量及亚基组成差异较大，蛋白结构组成的差异将导致酶催化性能及稳定性的不同。黄嘌呤氧化酶作为一种重要的氧化酶，其在医学诊断及...

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