藻类蛋白质组学技术研究进展

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藻类蛋白质组学技术研究进展

　摘要：藻类具有复杂多样的进化历史和生物学特征,不仅在生态系统中扮演着重要角色,而且

具有许多独特的基因和生物过程。随着后基因时代的到来,组学技术受到各界学者的高度重视,

近年来在藻类研究中也得到了应用。高通量技术在藻类研究领域中的应用,也大大促进了藻类蛋

白质组学的发展。本文综述了蛋白质组学技术在藻类品质差异鉴定、养殖胁迫作用、生理机制

方面的研究进展,并对其发展方向和应用前景进行了展望, 为从事藻类组学的研究者提供参考。

Application of proteomics technology in algae research

SUN Zu-Li WANG Jing YANG Xian-Qing WEI Ya LI Chun-Sheng XIANG Yue ZHAO Yong-Qiang

College of Life Science, Yantai University Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of

Agriculture and Rural Affairs, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of

Fishery Sciences Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic

University

　　 Abstract：Algae has complex and diverse evolutionary history and biological characteristics, not

only plays an important role in the ecosystem, but also has many unique genetic and biological

processes. With the advent of the post-gene era, the omics technology has been highly valued by

scholars from all walks of life, and has also been applied in marine algae research in recent years. The

application of high-throughput technology in the field of algae research has greatly promoted the

development of algal proteomics. This article reviewed the research progress of proteomics technology

in the identification of algae quality differences, the effects of aquaculture stress, and physiological

mechanisms, and prospected for its development direction and application prospects, so as to provide

reference for researchers engaged in algae omics.

　　 1　引言

作为中国、日本、韩国及东南亚国家的主要传统植物源海洋食品,以紫菜、麒麟菜、龙须菜、海

带等海洋藻类为原料开发的食品形式多样,市场规模逐年增大。近年来海藻的育苗栽培、养殖过

程与食品开发过程中品质控制技术逐渐受到重视。我国海藻资源丰富,海水养殖面积广,据统

计,2018 年我国藻类养殖产量高达 235.08 万吨,其中海洋藻类养殖总产量为 234.39 万吨,具有巨大

的碳汇潜力和经济开发价值[1]。迄今,虽然部分海藻已实现工业化培育、养殖和采收,但海洋藻

类仍旧作为初级产品进入销售市场,高新技术利用不足,精深加工产品较少。海洋藻类是一个高

度多样的生物群体,是地球上最古老的生命类群之一,不仅在生态系统中占据重要地位,而且在进

化关系上跨越原核和真核两界,拥有特殊的进化地位,因此其系统进化研究一直是生物学家关注

的热点。由于进化历史多样,不同的藻类在代谢途径、细胞进程、发育调控以及生活史等方面也

都有其独特性。藻类分子水平的研究将有助于更快、更准确地了解各种藻类的独特之处,获得丰

富的基因信息,以便更好地加以利用[2]。近年来,高通量测序技术在藻类基因组和转录组研究等

方面的应用已取得较大突破,这对藻类基因资源的研究和应用具有重要意义[2,3] 。

蛋白质组学技术在藻类研究中已广泛应用于品质差异鉴定、养殖胁迫、生理机制研究等方面。

已逐渐由基于凝胶的蛋白质组学向基于高通量技术的非凝胶蛋白质组学技术应用转变,大大促进

了藻类蛋白质组学的发展。目前,高通量蛋白质测序的进步已经允许常规产生数千种蛋白质的数

据集。Zhang 等[4]采用基于等重同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute

quantitation,iTRAQ)的蛋白质组学技术已鉴定出了甲藻的蛋白质数量有 3488 种,相比于基于凝胶

的蛋白质组学有了质的提高。但高通量蛋白质组学相比于基于凝胶的蛋白质组学需要更高的成

本,是应用受限的主要原因。本文综述了蛋白质组学概况与分类、藻类蛋白质组学样品制备方法

等,并在此基础上对蛋白质组学技术在藻类品质评价、养殖环境胁迫与生理机制等方面的研究进

展进行了分类论述,并对其发展趋势及面临的挑战进行展望,旨在为藻类蛋白质组学研究提供参

考。

　　 2　蛋白质组学

2.1 蛋白质组学概况

随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入了后基因组时代。生命科学的主要研究

对象已经从基因组转变为蛋白质组。尽管现在已有多个物种的基因组被测序,但在这些基因组中

通常有一半以上基因的功能是未知的。而蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现

者,对蛋白质结构和功能的研究将更有助于我们直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制

[5]。蛋白质本身的存在形式和活动规律,如翻译后修饰[6]、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象

等问题[7],仍需要我们利用蛋白质组研究技术直接对蛋白质进行研究来解决。虽然蛋白质的可

变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远比基于核酸水平的研究技术要复杂和困难得

多,但正是这些特性参与并影响着整个生命过程。因此在 20 世纪 90 年代中期,国际上产生了一

门新兴学科蛋白质组学(proteomics)[8,9],它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对

象。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生

命科学研究的核心内容之一。

蛋白质组学领域是基因组学和转录组学的补充,因为它提供了有关基因表达和调控的额外信息

[10]。蛋白质组学包括蛋白质表达水平的测定和蛋白质相互作用的研究。此外,蛋白质组学研究

旨在确定蛋白质的翻译后修饰,以及多蛋白复合物中蛋白质的组织及其在组织中的定位。一般来

说,蛋白质水平的测量可能比转录物水平的测量提供更准确的细胞催化能力表示,因为蛋白质与

观察到的细胞表型比 RNA 水平更直接相关。随着分析仪器和生物信息学的发展和改进,蛋白质

组学的研究日益成熟,它既能独立于基因组研究又能与基因组研究相互完善和补充,而其表达图

谱比基因组表达图谱更能真实地反映生物体的功能机制[11] 。

2.2 蛋白质组学分类

根据蛋白质分离、质谱分析方式的不同,蛋白质组学可分为:自下而上蛋白质组学(bottom-up

proteomics)和自上而下蛋白质组学(top-down proteomics)2 种[12,13]。前者是经典的蛋白质组学

研究方法,它的主要步骤包括:分离出感兴趣的蛋白,使用蛋白酶(如胰蛋白酶)进行消化,进行质谱

分析; “ ”而自上而下的蛋白质组学亦称鸟枪法 (shotgun)蛋白质组学,其基本过程是蛋白质混合物经

过简单分离或不经过分离就被酶解为肽段混合物,肽段混合物经液相色谱分离和离子化后,经串

联质谱进行分析。该方法具有高灵敏度和重现性,可在短时间内获得大量鉴定结果,因此在蛋白

质组研究中被广泛采用,但该方法存在蛋白质亚型信息易丢失、难以识别和表征蛋白质等缺点,

尤其是在缺乏全基因组序列信息的一些物种的蛋白质的鉴定与功能研究应用具有一定困难,可通

过结合转录组学技术开展多组学联用技术开展相关研究。

蛋白质组学最初的研究是通过双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)和氨基酸序列测定

(Edman 化学降解法)实现[14,15],但因其具有高通量和敏感度低、重复性差的缺点,近年来该项技

术的应用已不多见。

与传统的凝胶电泳及蛋白质免疫印迹技术针对蛋白质的较低通量的分析一种或几种蛋白质不同,

在藻类蛋白质组学研究过程中采用的 2-DE 技术可在单次分析中获取数百种蛋白质信息,但2-DE

技术存在分辨率低、重现性不高及步骤繁琐等缺点,尤其是待研究对象中低丰度的蛋白质难以在

2-DE 上进行有效分离或鉴定。此外,在制备2-DE 样品时常会遇到化学污染物导致蛋白质分离与

鉴定准确率低的问题[16,17]。虽然 2-DE 技术有敏感度低、重复性差等缺点的限制,但由于基于

凝胶技术的蛋白质鉴定具有更为简单和精确的优点,在早期的各种藻类蛋白质组学研究中具有较

为广泛的应用。最近关于海洋鞭毛藻类的蛋白质组学研究表明,在使用质谱技术鉴定之前,该领

域的大多数工作确实使用双向凝胶电泳来分离和可视化差异表达的蛋白质[18,19] 。

随着质谱技术的快速发展,通过使用从头测序策略解决了传统凝胶电泳的部分限制,其中使用手

动或自动从头肽序列分析获得部分或完整氨基酸序列[20]。最近,各种无凝胶定量蛋白质组学技

术的快速发展,例如同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute

quantification,iTRAQ)在藻类蛋白质组学中得到了应用,该方法直接将蛋白质消化成肽[21],然后

通过液相色谱分离肽,具有大的动态蛋白质分离范围,并已广泛应用于各种生物体。iTRAQ 目前

可使 8个样本同时相对量化,大大降低了实验过程中所引入的技术误差[22]。iTRAQ 技术在生命

科学领域中的应用价值已凸显, 必将在未来的蛋白质组学研究中得到更加广泛的应用。

总的来说,随着基因组和蛋白质组学信息的增加,大量蛋白质将有助于阐明藻类在海洋生态系统

中的重要作用以及它们与其他生物的相互作用,从而更好地了解生物过程和代谢途径[23]。蛋白

质组学将越来越多地应用于藻类研究,并在分子水平上对我们对藻类的认识做出重大贡献。关于

藻类蛋白质组学研究将在基于质谱技术的蛋白质组学在质谱仪器的更新与技术进步的驱动下逐

渐向高通量、高分辨率的方向发展[24] 。

　　 3　藻类组学样品制备

提取蛋白质是蛋白质组学研究的第一步。鉴于海洋藻类存在多种非蛋白成分,如细胞壁及多糖、

脂质和酚类化合物,使蛋白质的提取难度增大。在藻类蛋白质提取时通常会通过优化细胞破碎方

式、新型辅助提取技术及蛋白质沉淀分离等提取条件,达到获取适用于后续鉴定分析的目的

[25] 。

由于藻类具有较为坚韧的细胞壁,且可能含有大量的酚类化合物、碳水化合物以及色素等物质,

会干扰蛋白质组学分析,因此藻类蛋白质提取时通常靠先解决细胞壁破裂问题,常用的破壁方法

有:碱处理法、机械破碎法、超声波辅助法及液氮研磨法等[26,27] 。

在微藻研究方面,Safi 等[28]比较了手工研磨,超声处理,碱处理,和高压处理4种细胞破碎技术,对

比了具有脆弱和刚性细胞壁的微藻间释放的蛋白质浓度的差异,结果表明提取蛋白质的浓度不仅

受微藻细胞壁的机械刚性的影响,还取决于藻体本身细胞壁的结构与化学特性,与其他3种方法

相比,高压细胞破碎是对微藻细胞壁最有效的破碎方式。Safi 等[29]经化学水解和超声处理小球

藻(Chlorella vulgaris)后,细胞完整,但经球磨和高压均质处理后,大部分细胞失去球状形态。通过

对比多种细胞破碎技术对小球藻细胞壁的破碎效果,获得最好的细胞破碎方法是珠磨法,在珠磨

后获得最高浓度的蛋白质。Mcmillan 等[30]通过直接显微镜技术,鉴定了微波、热解、激光诱导

裂解、固体和液体剪切等方法对新鲜微藻样品细胞破碎的效果,结果表明最有效的破坏方法是高

功率激光处理,但仅略微好于微波。Ursu 等[31]运用了细胞裂解、超声波、酶或化学处理、热或

渗透冲击(反复冷冻/解冻)等技术研究了小球藻(Chlorella vulgaris)物种,解决了刚性细胞壁导致的

细胞内成分可用性较低的难题。Gao 等[32]采用直接裂解缓冲法、三氯乙酸-丙酮法、苯酚法和

苯酚/三氯乙酸-丙酮法4种蛋白质提取方法用于绿藻小球藻(Chlorella vulgaris)进行蛋白质组分

析。结果表明,在提取的蛋白质应用于鸟枪蛋白质组学研究方面,苯酚/三氯乙酸-丙酮法的提取效

果优于其他3 种方法。

在红藻研究方面,姚兴存等[33]用超声波辅助水提法提取条斑紫菜(Porphyra yezoensis)蛋白质,用

响应面法优化了蛋白质提取工艺,结果表明:在提取工艺条件为超声时间10 min、温度50℃、料

液比 10:1(mg/mL)时,实际提取率为37.6%,该研究结果表明超声波辅助提取法可以使紫菜蛋白提

取率从30%提高到近 40%,但还有一大部分蛋白不能提取,可能存在盐离子等杂质干扰的问题。

王会芳等[34]以龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为研究对象,比较了尿素/硫脲法、改良丙酮沉淀

法及Trizol 法3种方法对其蛋白质提取效果的影响,结果表明采用 Trizol 法辅以超声破碎提取龙

须菜总蛋白效果优于尿素/硫脲法和改良丙酮沉淀法,并建立了相应的双向电泳体系,为龙须菜属

和江蓠属其他海藻的蛋白质双向电泳分析提供参考。赵宇鹏等提出采用酚提取法能更好地提取

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)中的蛋白质,并能除去样品的盐离子及其他干扰杂质,在该提取方法

下可获得更高纯度的蛋白样品,为提高其他大型海藻的总可溶性蛋白提取提供参考[35]。随着植

物蛋白分离技术的不断发展,Poji?等[36]综述了亚临界水萃取(subcritical water extraction)静电分

离、反胶束萃取技术(reverse micelles extraction)、双水相体系萃取技术(aqueous two-phase

systems extraction)及酶、微波、超声、脉冲电能和高压等辅助萃取技术在植物源加工副产物中

蛋白质分离的应用现状,为植物源食品实现可持续的环境友好型生产提供参考。

综上所述,大型藻类蛋白质提取技术的核心是破碎细胞壁从而提高得率。一般的海洋藻类目前采

用较多的是超声波辅助提取法提取蛋白质,对于含有刚性细胞壁的海洋藻类最好的细胞破碎方法

是珠磨, 并配合苯酚法提取蛋白质。

　　 4　藻类蛋白质组学技术研究进展

4.1 蛋白质组学技术在海洋藻类品质差异鉴定方面的应用

Mohd 等[37]通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis,SDS-PAGE)研究了产自马来西亚的 15 种海藻,在绿藻、红藻及褐藻3种不同海藻

—间首次获取高质量蛋白质提取方法苯酚萃取法,为进一步进行藻类蛋白鉴定、功能解析的蛋白

质组学分析提供了基础。Wang 等[38]采用了基于二维电泳的比较蛋白质组学阐明参与海洋甲藻

亚历山大藻(Alexandrium catenella)的毒素生物过程的 53 种蛋白质。其中,在产生麻痹性贝类毒

素(paralytic shellfish toxins,PST)的蓝细菌中具有已知功能的9种蛋白质形成相互作用网络。该

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藻类蛋白质组学技术研究进展　摘要：藻类具有复杂多样的进化历史和生物学特征,不仅在生态系统中扮演着重要角色,而且具有许多独特的基因和生物过程。随着后基因时代的到来,组学技术受到各界学者的高度重视,近年来在藻类研究中也得到了应用。高通量技术在藻类研究领域中的应用,也大大促进了藻类蛋白质组学的发展。本文综述了蛋白质组学技术在藻类品质差异鉴定、养殖胁迫作用、生理机制方面的研究进展,并对其发展方向和应用前景进行了展望,为从事藻类组学的研究者提供参考。ApplicationofproteomicstechnologyinalgaeresearchSUNZu-LiWANGJingYANGXian-QingW...

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