新生成蛋白和修饰蛋白的检测技术综述

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新生成蛋白和修饰蛋白的检测技术综述

摘　　　　　要： “ ”一价铜催化的叠氮炔基的特异性反应通常被称为点击化学反应。点击化学反应作

为一种重要的分子连接方式,能够在分子水平实现特定小分子基团之间的简单高效连接。因其快

速高效、选择性高、条件温和、副反应少等优点,在蛋白质组学分析中有广泛应用,包括新生成

蛋白的鉴定和多种翻译后修饰蛋白的鉴定等方面。因此,深入研究点击化学反应在蛋白质组学中

的反应机制,对理解蛋白质的结构功能具有重要意义。本文综述了近年来点击化学反应在蛋白质

组学中的几类重要应用,并对其未来的发展趋势进行了展望。

　　　 Abstract 　：Cu(I)-catalyzed azide-alkyne specific reaction, popularly known as the “click

chemistry reaction”, is defined as an important molecular connection method, which can realize simple

and efficient connection between specific small molecule groups at the molecular level. Because of its

advantages such as high efficiency, high selectivity, mild conditions and few side reactions, click

chemistry reaction has been widely used in proteomics analysis, including the identification of newly

synthesized proteins and the identification of various post-translational modified proteins. Therefore,

in-depth study of the reaction mechanism of click chemistry reaction in proteomics is very important

for understanding the structure and function of proteins. The goal of this review is to highlight the

progress of several important applications of click chemistry in proteomics analysis in recent years,

and discuss the future trends of the click chemistry in proteomics.

　　 Keyword： Click chemistry reaction; Proteomics; Review;

　　 Fund 　：supported by the National Nature Science Foundation of China(No.81472030); the Jilin

Province Science and Technology Department Project(No.20180101267JC); the Graduate Innovation

Fund of Jilin University(No.101832018C070);

　　 1　　、引言

蛋白质组(Proteome)源于蛋白质(Protein)与基因组(Genome)两个词的组合,这个概念最早是由澳

大利亚 Macquarie 大学 Wilkins 等[1]提出。蛋白质组学研究的主要内容包括在蛋白质水平上大

规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰、蛋白质间的相互作用等,从而揭示蛋白质

的功能,已在疫苗筛选、指导治疗、临床药物开发及预后判断等领域发挥了重要作用[2,3]。

近年来,化学蛋白质组学在化学生物学领域发展迅速,其利用合成化学方法生成小分子探针,揭示

蛋白质的结构和功能。传统的蛋白标记探针主要有生物素、荧光基团等,但普遍存在降低蛋白质

活性、对极性变化不够敏感等缺点[4,5]。点击化学的出现极大地降低了因探针掺入对蛋白活性

的影响。点击化学是指通过小分子基团的拼接,简单高效地完成 C-X-C 杂原子化学合成的一类

组合化学方法。目前, 常用的点击化学反应主要包括铜催化的叠氮-炔基环加成反应(Copper-

catalysed azide-alkyne cycloaddi-tion reaction, CuAAC)、直接促进的叠氮-炔基环加成反应(Strain-

promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC) 、逆电子需求的 Diels-Alder 反应(Inverse electron

demand Diels-Alder reaction, IEDDA)和施陶丁格链接反应(Staudinger ligation)4 类[6]。其中,

CuAAC 是较为经典的点击化学反应, 该反应是指由 Cu+催化叠氮化合物与炔基化合物, 生成三

唑五元环化合物的共价加成反应, 如图 1所示。该方法反应效率高, 副反应少, 反应条件温和,具

有很高的化学选择性且不受水氧干扰、环境污染小等优点[6]。近年来, 点击化学反应与基于质

谱法的蛋白质组学研究方法的结合在生物学领域广泛应用, 特别是为新生成蛋白[7]、棕榈酰化

修饰蛋白[8]、糖基化修饰蛋白[9]及磷酸化修饰蛋白的检测提供了方法, 在蛋白质与蛋白质的相

互作用[10]、microRNA 生物合成[11]和microRNA 前体与蛋白质相互作用[12]方面也有广泛应

用。点击化学的使用对探索蛋白质生物学起到了巨大的推动作用。本文对基于点击化学反应在

蛋白质组学研究中的几类重要生物学应用进展进行了综述。

图1 点击化学反应原理[6]

Fig.1 Schematic of click chemistry reaction[6]

2　、新生成蛋白的检测

蛋白质的合成是一个动态过程, 在正常和病理条件下, 细胞会通过产生新生成蛋白对环境变化做

出反应, 准确检测蛋白质对环境扰动所做出的反应对理解其潜在作用机制具有十分重要的意

义。新旧蛋白质共享相同的氨基酸库, 在生物学上难以区分, 因此有必要对新生成蛋白进行特殊

标记以进行定性与定量分析。传统标记方法使用稳定同位素氨基酸标记法(Stable isotope

labelling by amino acids in cell culture, SILAC)[13]比较扰动前后蛋白质的表达变化。相较于极高

丰度的原有蛋白质, 新生成蛋白质常因丰度太低, 无法实现在大多数质量分析仪的定量动态范围

内的检测[14], 因此 SILAC 对于测量蛋白质合成的短时段内变化并不是最佳的方法。已有研究

发现了两种非天然氨基酸叠氮高丙氨酸(Azidohomoalanine, AHA)和高炔丙基甘氨酸

(Homopropargylglycine, HPG), 它们可以在细胞的正常蛋白质合成时掺入到该蛋白的一级结构中,

并且无明显细胞毒性[15,16]。生物正交非天然氨基酸标记法(Bioorthogonal noncanonical amino

acid tagging, BONCAT, 如图 2所示[17])利用此特点, 通过代谢标记引入AHA 或HPG[18,19]这种

小分子基团甲硫氨酸类似物。将被标记的细胞进行裂解后, 通过点击化学反应将带有炔或叠氮

化物的亲和标签共价连接在目的蛋白上, 再经过亲和素琼脂糖凝珠对目的蛋白进行纯化富集, 最

后将富集产物酶解成多肽, 利用高通量质谱进行分析检测。该方法具有特异性强、灵敏度高等

优点[20,21], 可以选择性富集新生成蛋白, 实现对新生成蛋白更深入的分析, 从而促进细胞间相

互作用的生物学的研究发展。

图2 使用BONCAT 方法对新生成蛋白进行标记、检测和鉴定[17]、

Fig.2 Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT) strategy for labeling, detection and

identification of newly synthesized proteins[17]

该方法自建立以来, 在动态蛋白质组学的分析中得到广泛应用。Shen 等[22]采用Bioorthogonal

noncanonical amino acid tagging (BONCAT)与MS 联用技术对哺乳动物细胞进行了研究, 发现了

数百个新生成蛋白在视觉条件时视神经支配区急剧增加; 作者进一步发现, Rab3 家族成员中的

突触蛋白 Rab3a 、Rab3b 和Rab3c 受到视觉神经的差异调节, 在视觉刺激的顶盖脑中Rab3b 和

Rab3c 的表达量显着增加, 而Rab3a 显着减少, 说明 Rab3 家族成员可能在体内介导视觉依赖的行

为可塑性中扮演不同的角色。Howden 等[23]利用 AHA 标记并结合了 SILAC 的方法

(Quantitative non-canonical amino acid tagging, QuaNCAT), 只需要标记细胞数小时或喂食/注入动

物1～4天, 即可实现对低丰度新生成蛋白的定量分析。在该研究中, 利用重同位素标记的氨基

酸对T细胞刺激后分泌的新生成蛋白进行标记, 随后通过亲和素微珠对目的蛋白进行富集, 最后

利用 MS 对新生成蛋白进行了定量检测。Ma 等[24]的方法更简单直接, 使用重同位素标记的

AHA(Heavy isotope-labeled azidohomoalanine quantification, HILAQ)进行新生成蛋白的标记, 再

通过点击反应添加生物素, 接着对标记的蛋白进行沉淀洗涤和消化。该研究组对 HT22 细胞氧化

模型的新生成蛋白进行了定量检测, 发现 226 种蛋白质的丰度发生了两倍的变化, 108 种蛋白质

在细胞死亡途径中得到富集, 证明了HT22 细胞作为一种分子工具, 在研究神经退行性疾病涉及

的细胞凋亡的过程中十分有效。他们还将 HILAQ 法与 QuaNCAT 法进行比较发现, HILAQ 使用

肽水平富集, 已被证明是比QuaNCAT 中使用蛋白质水平富集的更灵敏的方法, 且HILAQ 法定

量的新生成蛋白是 QuaNCAT 法定量的3.5 倍以上。综上, HILAQ 方法是一种新型的新生成蛋白

的定量检测方法, 通过使用重同位素的标记简化了新合成蛋白质组的分析过程, 并且具有更高的

灵敏度。崔秀云等[25]首先利用脂多糖刺激 Raw264.7 细胞产生肿瘤坏死因子 α, 然后通过代谢

掺入 AHA, 并利用点击化学反应, 使细胞中的新生成的蛋白标记上生物素标签, 再利用抗体对标

记蛋白进行特异性捕获, 从而达到检测特定的新生成蛋白的目的。该研究为检测特定的微量新

生成蛋白提供了一种可借鉴的方法。

除了上述 AHA 或HPG, 一种非天然氨基酸对-叠氮-L-苯丙氨酸(p-azido-L-phenylalanine, azF)也

被用于蛋白质的代谢标记[26,27]。Smits 等[28]开发了一种 Click-MS 的新型检测方法, 利用琥珀

抑制技术选择性地将琥珀终止密码子(UAG)掺入到目的蛋白中, 同时添加特定的 tRNA 和酰氨

基-tRNA 合成酶(aa-RS)。然后, 通过无铜点击化学反应对掺入对-叠氮-L-苯丙氨酸的目的蛋白进

行特异性捕获, 最后利用质谱检测, 实现单个目的蛋白的选择性富集。研究者利用此方法, 从哺

乳动物细胞粗提取物中特异性富集了两种目标蛋白: 信号转录与激活因子 1(STAT1)和甲基CpG

结合域蛋白 3(MBD3)。与使用AHA 或HPG 的蛋白质标记策略有所不同, 该方法实现了对单个

目的蛋白的特异性富集, 对于揭示特定目标蛋白的代谢情况以及与其它蛋白间的相互作用具有

重要意义。

　 3 　、翻译后修饰蛋白的检测

　　 3.1 　、棕榈酰化修饰蛋白的检测

棕榈酰化修饰蛋白的传统检测方法是酰基生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange, ABE)[29] 。

ABE 法是先用碘乙酰胺封闭蛋白质半胱氨酸上的自由巯基, 利用羟胺选择性地切割蛋白质半胱

氨酸和脂肪酸修饰基团之间的硫酯键, 再将带有生物素的巯基特异性反应活性试剂与新产生的

自由巯基反应, 最后对目的蛋白 S-棕榈酰化修饰蛋白进行纯化、富集和检测。已有研究采用

ABE 法对生物样本中的棕榈酰化修饰蛋白进行了数量及修饰位点的鉴定分析[30,31]。尽管

ABE 法在检测棕榈酰化修饰蛋白质方面有了很大进展, 但由于羟胺切割的是硫酯键, 而不是 S-

棕榈酰化修饰的特异位点, 其它对羟胺敏感的硫酯键蛋白也有可能被同时富集[32], 因此存在假

阳性率高、灵敏度低、放射性强等缺点, 极大限制了在棕榈酰化修饰蛋白检测方面的应用。

近年来, 研究者发展了另一种蛋白质棕榈酰化修饰的分析方法: 化学报告基团法(Chemical

Reporter)[33], 该方法能够区分S-脂肪酰化(棕榈酰化修饰)的蛋白和 N/O-脂肪酰化的蛋白。与上

述ABE 法不同的是, 该方法将含有炔基的棕榈酸类似物代谢掺入细胞蛋白质, 然后通过点击化

学方法, 选择性地将带叠氮基团的生物素连接到标记了炔基探针的蛋白质上, 接着使用羟胺对棕

榈酰化修饰蛋白的硫酯键处进行特异性切割, 最后采用抗生物素琼脂糖凝珠对蛋白质进行富集

和鉴定, 从而实现对棕榈酰化修饰蛋白的检测, 如图 3所示。炔烃和叠氮化物脂肪酸探针通常都

能有效标记细胞脂肪酰化蛋白质, 其中炔基探针因具有较低的背景信号及更高的检测灵敏度和

检测效率等优点应用更为广泛[34]。同时, 添加一个叠氮基团到脂肪酸链上可能会影响脂肪酸的

疏水性, 而炔基可保留脂肪酸碳链的疏水性, 减少对脂肪酸物理化学性质的改变及其与脂质间的

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摘要：

新生成蛋白和修饰蛋白的检测技术综述　　摘　　　　　要：“”一价铜催化的叠氮炔基的特异性反应通常被称为点击化学反应。点击化学反应作为一种重要的分子连接方式,能够在分子水平实现特定小分子基团之间的简单高效连接。因其快速高效、选择性高、条件温和、副反应少等优点,在蛋白质组学分析中有广泛应用,包括新生成蛋白的鉴定和多种翻译后修饰蛋白的鉴定等方面。因此,深入研究点击化学反应在蛋白质组学中的反应机制,对理解蛋白质的结构功能具有重要意义。本文综述了近年来点击化学反应在蛋白质组学中的几类重要应用,并对其未来的发展趋势进行了展望。　　　Abstract　：Cu(I)-catalyzedazide-alkynes...

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