脱氧核酶活性的抑制与恢复方法

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脱氧核酶活性的抑制与恢复方法

端粒酶（ Telomerase ）作为一种核糖核蛋白，其主要功能是催化端粒（ Telomere ）末端不断

延伸（ TTAGGG）n序列，从而克服细胞分裂过程中的端粒缩短问题，维持端粒的适当长度与

稳定性。尽管端粒酶在抗衰老研究中具有良好的前景，但它也是导致肿瘤细胞无限分裂的重要

因素。研究表明，端粒酶在 85%以上的人类肿瘤细胞中被高表达，而在正常体细胞中的表达

量则极低甚至不表达[1]. 因此，端粒酶也被认为是最具通用性的癌症诊断与治疗的标志物之

一，受到日益广泛的关注。

近年来，基于光谱、电化学以及纳米技术的各种端粒酶检测新方法不断涌现[2,3]. 但迄今最常

用的仍是基于聚合酶链式反应（ PCR ）的端粒重复序列扩增（ Telomeric repeat amplification

protocol,TRAP ）方法[4]. 这主要是因为端粒酶的含量非常低，即使在肿瘤细胞中也只有 50 个

分子左右[5], 因此提高检测的灵敏度始终是该研究领域必须面对的挑战之一。尽管 TRAP 方法

十分有效，可以检测低至几个细胞甚至单个细胞内的端粒酶，但其操作过程比较复杂、费时，

而且容易产生假阳性信号。其它一些非 PCR 方法，例如电致化学发光[6]、表面等离子体共振

（SPR）[7] 、石英晶体微天平（ QCM）[8] 、生物条码（ BioBarcode）[9]和指数等温扩增端粒

重复序列（ EXPIATR）[10,11]等，虽然也取得了较高的灵敏度，但同样具有体系复杂、操作

繁琐及依赖精密仪器等局限。因此，亟需发展一种更加简单、灵敏的端粒酶检测新方法。

脱氧核酶（ DNAzyme ）是通过体外分子系统进化技术（ SELEX ）筛选得到的一种具有催化

功能的单链 DNA 片段[12~14]. 由于具有催化活性高、特异性好、稳定性强、容易合成以及信

号转换机制灵活等优点，使其在生物传感领域获得了广泛的应用。 2004 年，Willner 等[15]首

次应用具有过氧化物酶活性的脱氧核酶实现了端粒酶检测。但该方法涉及多步表面修饰，操作

复杂，而且容易受到细胞内端粒序列的干扰。考虑到端粒 DNA 与脱氧核酶（

TGGGTAGGGCGGGTTGGGA ）的序列均固定不变，通过设计巧妙的探针来实现简便的端粒

酶检测仍是一项十分艰巨的挑战[16]. 本文研究了脱氧核酶活性的抑制与恢复方法，通过优化发

卡结构设计，并结合支点介导链置换技术（ Toehold-mediated Strand Displacement）[17],建立了

一种简单、无标记的端粒酶检测新方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DNA 序列（见表1 ）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用高效液相色谱纯

化；2,2'-联氨- 双（3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸）二胺盐（ABTS2-, 纯度98% ）、氯高铁血红素

（Hemin, ≥纯度98% ）、乙二醇双（2- 氨基乙基醚）四乙酸（EGTA, 纯度97% ）、苯甲基-磺

酰F （PMSF, 纯度98. 5% ）和 3-[3- （胆酰胺丙基）二甲氨基]-1- 丙磺酸内盐（CHAPS, 纯度

98% ）均购自 Sigma-Aldrich ≥公司；过氧化氢（质量分数 30% ）和 Tris-HCl 缓冲溶液（

pH=7. 5 ）购自 Fisher 公司；实验用水为过滤除菌的超纯水。

1.2 实验过程

1.2.1 细胞培养将 Hela 细胞置于37 ℃ 二氧化碳恒温箱中[95% （体积分数）空气，5%CO2]培

养，培养基为 RPMI 1640, 含10% （质量分数）胎牛血清蛋白（ FBS ）及 100 IU/L 青霉素。

细胞数量于每次实验前采用细胞计数板测定。

1.2.2 端粒酶的提取采用通用的 CHAPS 方法提取端粒酶[18]. 首先采集处于指数生长期的Hela

细胞，取 106 个细胞置于500 μL 离心管中，用 PBS 缓冲溶液洗涤 2 次；加入200 μL CHAPS

裂解溶液[0. 5% （质量分数） CHAPS + 10 mmol/L Tris-HC1 （pH = 7. 5 ）+ 1 mmol/L MgC12+

1 mmol / L EGTA +5 mmol / L 2-mercaptoethanol+0. 1 mmol / L PMSF+10% （质量分数）

glycerol], 并用移液器吹打直至细胞均匀分散；将该溶液置于冰浴中孵育 30 min, 再于4 ℃ 下以

16000 r/min 转速离心20 min, 然后小心收集上层清液（不超过160 μL ）, 并分装于多个50 μL 离

心管中，于-80 ℃下冻存待用。

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摘要：

脱氧核酶活性的抑制与恢复方法端粒酶（Telomerase）作为一种核糖核蛋白，其主要功能是催化端粒（Telomere）末端不断延伸（TTAGGG）n序列，从而克服细胞分裂过程中的端粒缩短问题，维持端粒的适当长度与稳定性。尽管端粒酶在抗衰老研究中具有良好的前景，但它也是导致肿瘤细胞无限分裂的重要因素。研究表明，端粒酶在85%以上的人类肿瘤细胞中被高表达，而在正常体细胞中的表达量则极低甚至不表达[1].因此，端粒酶也被认为是最具通用性的癌症诊断与治疗的标志物之一，受到日益广泛的关注。近年来，基于光谱、电化学以及纳米技术的各种端粒酶检测新方法不断涌现[2,3].但迄今最常用的仍是基于聚合酶链式反应（...

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