探讨了微晶胞接种法和大晶胞接种法在结晶时的应用

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探讨了微晶胞接种法和大晶胞接种法在结晶时

的应用

蛋白质晶体学是研究蛋白质结构与功能关系的重要方法．近年来，同步辐射光源强度的提高和

晶体结构解析方法的更新都获得了快速的发展，但是蛋白质的结晶仍然是晶体学中的瓶颈．蛋

白质的结晶包括最初的结晶条件的摸索( de novocrystallization screening ) 和结晶条件

的优化( crystallization optimization) 两个步骤．最初条件的摸索主要依靠高通量的筛选．结晶

条件的优化除了改变蛋白和沉淀剂浓度，加入添加剂等方法外，晶胞接种法在其中具有重要的

作用．晶胞接种法包括微晶胞接种法和大晶胞接种法．微晶胞接种法主要用于得到单晶来改

善衍射质量，而大晶胞接种法则主要用于得到大体积的单晶来提高衍射分辨率．由于第三代

X-光同步辐射的强度非常高，蛋白晶体 X- 光衍射所需体积一般而言在 10 －6 ～10 －4立方毫

米就足够了，因此大晶胞接种法在 X- 光衍射晶体结构学中的应用已经趋少．但是，X-光衍射

“ ”是对蛋白质中原子或离子的电子产生的衍射，它只能测出电子含量比较多的重原子或离子(

碳、氮、氧、磷、硫等) 的空间位置，而对只有极少电子的极性氢原子( H3O+ ，－

OH，H2O ，－ NH －，－ NH2 ，－ NH3 等基团中的氢原子或离子) 则无法检测出，即使是在

高于 1. 0 ? 分辨率的 X-光衍射晶体结构中也是如此．蛋白晶体的中子衍射是对原子或离子的原

子核产生的衍射．氘原子(2H) 作为氢原子(1H) 的同位素，对中子衍射非常敏感．将蛋白质中

的氢氘置换后，氘的空间位置在 2. 0? 的分辨率就可以清晰地被中子衍射检测到，这样我们可

以很准确地推断出原先蛋白质中氢的位置．得到蛋白质中氢原子的空间位置对研究蛋白催化反

应的机理、蛋白的热动力学和蛋白- 药物相互作用的分析都具有重要的意义．然而，由于技术

原因，中子辐射的强度只有 X- 光辐射强度的百万分之一，因此在大多数情况下只有 1 立方毫米

以上体积的巨大晶体才有足够的分辨率观察到蛋白质中的氢原子或质子．截至到 2013 年8 月

30 日，在国际蛋白结构数据库中，蛋白晶体的 X- 光衍射结构有 674 789 个，而中子衍射结构

只有区区 43 个，只占晶体结构总数的 0. 06% ．造成这种结果的主要原因除了晶体的中子衍射

所需时间长( 10 d 以上) 以外，得到 1 立方毫米以上体积的巨大晶体相当困难是另一个主要原

因．因此，如何进一步发展大晶胞接种法，获得巨大体积的蛋白晶体就显得非常重要．本文以

非聚合性肌动蛋白( AP-actin)和里氏木聚糖酶为研究对象，详细探讨了微晶胞接种法和大晶胞

接种法在结晶时的应用．非聚合性肌动蛋白的 X-光衍射晶体结构虽然已经发表，但是通过连

续多步微晶胞接种的方法得到高分辨率的单晶在相关文献中没有报道．里氏木聚糖酶虽然已经

被研究多年，在蛋白晶体结构数据库中有 293 个X-光衍射晶体结构，但是中子衍射晶体结构

则一个也没有．本文讨论了如何通过大晶胞接种的方法得到体积到达2 立方毫米的里氏木聚糖

酶晶体，其中子衍射分辨率达到2. 0 ?，从而为它的中子衍射晶体结构的研究打下坚实的基

础．

1 材料与方法

1. 1 材料

木聚糖酶突变体( N44D 和E177Q) 的基因构建购自美国DNA2. 0 公司( 里氏木聚糖酶基因采用

编码子优化合成后，克隆到pJexpress401 表达载体上) ．非聚合性肌动蛋白( AP-actin) 由美国佛

蒙特大学 Kathleen Trybus 实验室提供．蛋白胨( trypton) 和酵母提取物( yeast extract) 购自美国

Invitrogen 公司．HiTrap SP-Sepharose 强阳离子交换柱和HiLoad 16 /60 Superdex75 pg 分子筛柱

购自美国GE 公司．结晶试剂盒Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG·IonTM、PEG Ｒx购自美

国Hampton Ｒesearch 公司．其它化学试剂购自美国Sigma 公司．大肠杆菌 BL21-gold 细胞株

由本实验室保存．

1. 2 木聚糖酶的表达与纯化

100 μL 感受态细胞在冰上溶解后，加入 1 ～3μg 的质粒．静置10 min 后，放入42 ℃ 水浴 45

s ．在冰上冷却 5 min 后，加入 900 μL 无菌的溶源性肉汤( lysogeny broth，LB) ，放入37 ℃培

养1 h ．6 000 g 离心后，去掉 900 μL 上清液．剩下100 μL 培养液同细胞混匀后铺到含卡拉霉

素的琼脂糖平板上，37 ℃ 培养过夜．挑出长出的单菌落进行细胞培养和蛋白表达．转化细胞

接种到 50 mL 的LB ( Luria-Bertani) 培养液 37 ℃ 培养过夜．取10 mL LB 培养液到1 LEnfor’s

基本培养基中，37 ℃ 培养到A600 吸收值在0. 4 ～0. 8 之间后，降温到18 ℃ ，加入 0. 5

mmol/LIPTG 诱导蛋白表达．6 000 g 离心去除培养液后，细胞用 50 mmol/L MES 缓冲液( pH6.

0) 悬浮．细胞用超声破碎后，15 000 × g 离心去除细胞碎片．上清液过 20 mL HiTrap SP-

Sepharose 填充柱进行第一次蛋白纯化．用 0 ～1 mol/L 氯化钠浓度梯度洗脱后，纯化的蛋白用

Centricon( Millipore 公司产品) 离心浓缩到小于2 mL 体积．浓缩液过 12 mL HiLoad

16/60Superdex 75 pg 分子筛柱在0. 1 mol / L Tris 缓冲液( pH8. 5) 进行第二步蛋白纯化．洗脱液

的纯度经 SDS-PAGE 检测后，浓缩到30 ～50 mg / mL 在-80 ℃ 保存．

1. 3 木聚糖酶突变体 E177Q 的结晶和微晶胞接种

木聚糖酶突变体 E177Q 和底物木聚六糖( xylohexaose) 形成的复合物( E177Q-X6) 的结晶

条件用悬滴法来进行摸索: 1 μL 复合物溶液( 30 mg/mL E177Q，0. 1 mol / L NaCl，0. 1 mol / L

Tris，pH8. 5，50 mmol / L Xylohexaose) 与1 μL 池液( 具体成分视结晶条件试剂盒的成分而不

同) 混合后，与 0. 5 mL 池液在封闭的环境下平衡．将最初得到的 E177Q-X6 晶体聚合物( Fig ．

1A) 从结晶溶液中转移到沉淀剂浓度升高了 2% ～5%的稳定液中( stabilization solution) ，然后

用灼烧过的毛细玻璃管压碎，再将体式显微镜也无法见到的微晶体溶液用稳定液梯度稀释 10

倍、100 倍、1 000 倍和10 000 倍．从上述100 倍、1 000 倍和10 000 倍的稀释液中分别吸取

0. 4 μL 小晶体溶液，加入到预平衡好的蛋白结晶溶液中( 结晶沉淀剂浓度比最初结晶溶液的沉

淀剂浓度降低 2% ～5%) ．

1. 4 木聚糖酶突变体 N44D 的结晶和大晶胞接种

木聚糖酶突变体 N44D 的无配体蛋白溶液( 30mg/ mL N44D，0. 1 mol / L NaCl ，0. 1mol / L

Tris( pH8. 5) ) 的最初结晶条件采用悬滴法用不同试剂盒来筛选( 同上) ．将得到的 N44D 单晶从

结晶溶液中转移到降低了沉淀剂浓度( 2% ～5%) 的池液中，多次清洗后，再将这个单晶转移

到预平衡好的大体积( 100 μL)蛋白结晶溶液中( 结晶沉淀剂的浓度同样比最初降低 2% ～5%)

．由于悬滴法不能用大体积蛋白溶液，本文采用美国Hampton Ｒesearch 公司生产的可以承载

大体积的9 孔玻璃盘在三明治盒子( Sandwich Box) 中以坐滴的方式来得到大体积单晶．

1. 5 肌动蛋白的结晶和多次微晶胞接种

非聚合性肌动蛋白同 ATP 复合物( 10 mg/mLactin，5 mmol / L Tris-HCl ，pH 8. 2，0. 2 mmol /

LCaCl2，0. 1 mmol/L sodium azide，0. 5 mmol/L DTT，0. 2 mmol / L ATP) 结晶条件用悬滴法来

筛选 ( 同上) ．肌动蛋白的微晶胞接种过程与木聚糖酶 E177Q-X6 过程相同，但是重复多次．

1. 6 晶体衍射数据的收集和处理

晶体的 X-光衍射数据收集过程如下: 将木聚糖酶晶体从结晶溶液捞出后，在含 20% 甘油的稳定

液中浸泡一下后捞出，在液氮中快速冷冻．20% 甘油作为冷冻保护剂( cryoprotectant) 使得冷冻

的晶体周围不会有冰晶形成．肌动蛋白晶体溶液中含有 25%2-methyl-2，4-pentanediol( MPD)

，本身可以作为冷冻保护剂，可以将晶体直接在液氮中冷冻．晶体衍射数据由Ｒigaku Ｒ

UH3 Ｒ发生器和Mar345 成像板构成的 X- 光衍射仪收集，并用HKL2000 软件处理．晶体的中

子衍射数据收集过程如下: 将木聚糖酶突变体 N44D 的大体积晶体( 2 ～3 立方毫米) 放入石英

玻璃管中，然后在玻璃管的末端加入用重水( deuterium oxide) 配制的稳定液．在 18 摄氏度放

置4 周后，晶体中 80% 可置换氢已经被氘取代．晶体的中子衍射数据在美国Los Alamos 国家

实验室的蛋白晶体站( Protein Crystallography Station，PCS)收集后，用劳厄中子衍射( Laue

Neutron Diffraction) 程序处理．

2 结果

2. 1 微晶胞接种可以极大地改善晶体衍射质量

用结晶条件试剂盒筛选木聚糖酶突变体 E177Q 与底物木聚六糖形成的复合物 E177Q-X6 的悬滴

法结晶条件如下: 1 μL 的池液( 0. 2 mol/L ammoniumcitrate tribasic( pH 7. 0 ) ，20% PEG 3350 )

加1 μLE177Q-X6 复合物溶液( 30 mg / mL E177Q，0. 1mol / LNaCl ，0. 1 mol / L Tris ，pH8.

5 ，50 mmol / LXylohexaose) ，与 0. 5 mL 池液平衡 2 d 后晶体形成，5 d 后晶体长到最大．由

于最初获得的 E177Q-X6 复合物晶体长在一起无法分离成单晶，我们从原来的多晶中切下一小

块长得最好的部分，压碎，得到非常小的细微晶体，再用微晶胞接种的方法得到单晶．单晶的

X-光衍射分辨率可以达到1. 1 ?．肌动蛋白的悬滴法结晶条件如下: 1 μL 蛋白溶液与1 μL 池液 (

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摘要：

探讨了微晶胞接种法和大晶胞接种法在结晶时的应用蛋白质晶体学是研究蛋白质结构与功能关系的重要方法．近年来，同步辐射光源强度的提高和晶体结构解析方法的更新都获得了快速的发展，但是蛋白质的结晶仍然是晶体学中的瓶颈．蛋白质的结晶包括最初的结晶条件的摸索(denovocrystallizationscreening)和结晶条件的优化(crystallizationoptimization)两个步骤．最初条件的摸索主要依靠高通量的筛选．结晶条件的优化除了改变蛋白和沉淀剂浓度，加入添加剂等方法外，晶胞接种法在其中具有重要的作用．晶胞接种法包括微晶胞接种法和大晶胞接种法．微晶胞接种法主要用于得到单晶来改善衍射...

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