探究以荧光碳点为荧光源和载体制备了高选择性的荧光牛血红蛋白

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探究以荧光碳点为荧光源和载体制备了高选择

性的荧光牛血红蛋白

摘要：以荧光碳点为载体， 3- 氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，牛血

红蛋白为模板分子，采用溶胶-凝胶法制备出对牛血红蛋白具有高选择性识别性能的新型荧光

印迹聚合复合材料 . 采用红外光谱（IR ）和扫描电子显微镜（SEM ）对聚合物进行表征，结

果表明，分子印迹聚合物包覆在荧光碳点表面，印迹因子为 4.60.此对牛血红蛋白具有高选择

性，相对于卵清蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白的选择因子分别为 4.38、4.73 和3.66.在最佳

条件下，此对牛血红蛋白的响应线性范围为 0.1~10.0μmol/L, 检出限为 23.0 nmol/L.将此用于牛

血液样品中牛血红蛋白的测定，回收率为 99.0%~102.5%.

Fluorescence Carbon Dot-based Imprinted Polymer for Highly Selective Detection of Bovine

Hemoglobin

Abstract:A novel fluorescent imprinted polymer with selective recognition of hemoglobin was

prepared by the sol-gel method using fluorescent carbon dots as the carrier material, 3-

aminopropyltriethoxysilane as the functional monomer, tetraethoxysilane as the crosslinking agent and

bovine hemoglobin as template molecule. The results of IR and scanning electron microscopy showed

that the molecularly imprinted polymer was coated on the surface of fluorescent carbon dots. The

CDs@ MIP showed selective recognition properties for bovine hemoglobin with an imprinting factor

of 4. 60. Also the adsorption ability and specific recognition performance of were investigated, and it

was found that the CDs@ MIP had high selectivity toward bovine hemoglobin, and the selection

factors for ovalbumin, bovine serum albumin and human serum albumin were 4.38, 4.73 and 3.66,

respectively. Under the optimal conditions, the linear range of for bovine hemoglobin was 0. 1-10. 0

μmol/L and the detection limit was 23. 0 nmol/L. The CDs@ MIP was successfully used for the

determination of bovine hemoglobin in bovine blood samples with recoveries of 99.0%-102.5%.

Keyword:Molecular imprinting; Bovine hemoglobin; Fluorescent carbon dots;

1、引言

分子印迹技术是在交联剂作用下使模板分子与功能单体通过共价或非共价等作用形成聚合物，

脱除模板分子后在聚合物材料上留下与模板分子大小、形状和官能团都互补的三维空穴结构的

新技术[1].印迹聚合物具有稳定性高和选择识别性能高等优点[2].荧光型分子印迹聚合物结合了

荧光检测技术的高灵敏度和分子印迹聚合物的高选择性，在复杂基质中检测痕量物质展现出明

显优势[3]. 目前，制备荧光分子印迹聚合物主要有两种：一种是采用荧光型功能单体[4], 但这

类功能单体的制备过程通常比较复杂；另一种方法是将荧光纳米粒子，如半导体量子点[5]和

上转换纳米粒子[6] 等包裹在分子印迹聚合物中，其制备过程相对简便。目前，荧光印迹聚合

物已经成功用于检测溶菌酶[7]、四环素[8]、色氨酸[9] 等，但是绝大部分研究都是采用半导体

量子点为荧光源，这些基于重金属合成的半导体量子点对人和环境的毒害较大[10]. 因此，探

索简便、绿色的新型荧光印迹聚合物制备方法非常重要。

荧光碳点（CDs ）是一种新型碳材料量子点[11~13]. 相较于传统的半导体量子点和有机染料，

碳点具有低毒性、生物相容性、抗光漂白性、易于合成和功能化等优点，但未经修饰的碳点通

常量子产率低[14].研究者开发了化学还原法[15]、光化学还原[16]、碳点表面钝化[17]和碳点表

面修饰[18] 等技术提高碳点量子点产率；而基于荧光碳点的分子印迹聚合物也已成功制备，并

应用于环境污染物[19,20]、金属离子[21]、生物分子[22~25] 等的检测，而关于碳点的蛋白印迹

聚合物的研究还比较少。

本研究首先通过水热法合成裸 CDs, 然后用聚乙烯亚胺修饰 CDs, 通过溶胶-凝胶反应固定CDs

于BHb 印迹层中。制备得到的荧光印迹聚合物结合了碳点优良的荧光性能和分子印迹技术的

高选择性，为蛋白检测提供了高选择性和高灵敏度的快速检测方法。

2、实验部分

2.1 仪器与试剂

SIGMA HD 场发射扫描电子显微镜（德国蔡司公司）;Nicolet i S10 型傅里叶变换红外光谱仪

（美国尼高力公司）;F-7000 荧光光谱仪（日本日立公司）;UV-2550 紫外-可见分光光谱

仪、LC2010AHT 高效液相色谱（日本岛津公司）.

牛血红蛋白（BHb ）、牛血清白蛋白（BSA ）、卵清蛋白（OVA ）和人血清蛋白（HSA ）

购自 Sigma 公司；抗坏血酸（Ascorbic acid ）、聚乙烯亚胺（PEI ）、3- 氨丙基三乙氧基硅烷

（APTES ）、四乙氧基硅烷（TEOS ）、Triton X-100 （Tri, 纯度>99% ）、氨水溶液

（NH3·H2O, 25%~28%, w/V ）购自北京梦怡美生物科技有限公司。肝素钠抗凝牛血液购自鸿

泉生物科技有限公司。其它试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

2.2 荧光印迹材料制备

2.2.1 荧光碳点制备

荧光碳点的制备参考文献[24]的方法并稍做修改。称取 0.40 g 抗坏血酸分散于14.0 m L 蒸馏水

和6.0 m L 无水乙醇的混合液中，将混合物转移到高压反应釜中， 140℃反应1.0 h.取出反应

液，待冷却至室温后加入 1.0 m L PEI, 70℃下搅拌 3.0 h.将得到的混合溶液用蒸馏水透析出多

余的前体。最终所得产物在 60℃下真空干燥 2.0 h, 得到荧光 CDs, 以水配制成 1.2 g/L CDs 溶

液，备用。

2.2.2 制备

向20.0 m L 1.2 g/L CDs 溶液中加入 0.12 m L TEOS 和0.20 m L NH3·H2O （25%, w/V ）, 在室

温下搅拌 1.0 h 得混合溶液 1.取20.0 mg BHb 溶于 5.0 m L 蒸馏水中，加入 0.08 m L APTES, 在

室温下搅拌 30.0 min 得混合溶液 2.将混合液 2加入到混合液 1 中，在室温下继续搅拌反应6.0

h. 离心，用蒸馏水洗去未反应的单体和产生的低聚物，再用0.5%Tri 洗脱印迹聚合物中的牛血

红蛋白，重复多次，直到采用紫外-可见分光光度计在406 nm 处检测不到模板蛋白为止。在

50℃下真空干燥 3 h, 得到荧光印迹聚合物。

荧光非印迹聚合物制备与上述过程相同，只是不加入模板分子。

2.3 性能表征

分别采用扫描电子显微镜表征印迹材料的形貌，傅里叶变换红外光谱仪测定材料的红外光谱

图，荧光光谱仪测定荧光材料的荧光光谱图。荧光测试时激发波长为375 nm, 激发和发射的狭

缝宽均为10 nm, 光电倍增压为500 V.使用高效液相色谱验证实际样品中的 BHb 浓度。色谱柱

为Spherigel C18 柱（250 mm×4.6mm, 5μm ）.流动相为 p H 7.0 的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液，

流速为0.5 m L/min.注射样品体积为10.0μL, UV 检测器的波长为406 nm.所有检测的溶液用

0.45μm 聚四氟乙烯膜过滤。

2.4 牛血红蛋白荧光检测原理

当未结合 BHb 时，印迹层包裹的碳点被光激发时，会产生明显的绿色荧光；当和BHb 溶液混

合时，由于印迹层中存在与模板蛋白大小、形状和官能团互补的结合位点，模板蛋白可与印

迹位点结合，这时印迹层内的碳点上的电子转移到 BHb, 导致碳点的荧光发射减弱，发生的荧

光猝灭现象[27], 且BHb 对的荧光猝灭遵循 Stern-Volmer 方程[8]:

其中， F0 是不存在BHb 时或的初始荧光强度， F是BHb 存在下的荧光强度， KSV 是BHb 的

猝灭常数，C是BHb 的浓度。CDs@MIP

和CDs@NIP

的猝灭常数KSV 之间的比值定义为印记

因子（IF ）, 用于评估该材料的选择性；F0/F-1 为猝灭效应[28], 用于评估分析物对该材料的荧

光影响强度。

2.5 荧光印迹聚合物识别性能

2.5.1 响应时间的影响

通过动态吸附实验测定荧光印迹材料对 BHb 的吸附速率。分别称取 CDs@MIP

和CDs@NIP 7.0

mg, 加入到 5.0 m L 10.0μmol/L BHb 溶液中，室温下振荡吸附，每隔 4 min 测定印迹聚合物和

非印迹聚合物的荧光强度变化。

2.5.2 吸附容量

通过等温吸附实验测定荧光印迹材料对 BHb 的吸附性能。分别称取 20.0 mg CDs@MIP

和

CDs@NIP

加入到 10.0 m L 20.0μmol/L BHb 溶液中，在室温下振荡吸附 20 min. 离心分离，采

用紫外-可见分光光度计分别测定上清液中 BHb 浓度。

2.5.3 荧光响应性能

称取 CDs@MIP

和CDs@NIP 7.0 mg 加入到 5.0 m L 系列浓度（0.1~10.0μmol/L ）的 BHb 溶液

中孵育 20 min 后，分别检测印迹聚合物和非印迹聚合物的荧光强度。

2.5.4 选择性识别

分别称取多份 CDs@MIP

和CDs@NIP 7.0 mg 加入到 5.0 m L 5.0μmol/L 的OVA、BSA、HSA 和

BHb 溶液中孵育 20 min, 测定溶液中印迹聚合物和非印迹聚合物的荧光强度。考察不同蛋白质

存在下印迹聚合物和非印迹聚合物荧光强度变化情况（ΔF=F0-F, 其中 F0 为不加蛋白质时聚合

物溶液的荧光强度， F 为蛋白质存在下混合溶液的荧光强度） .

2.5.5 实际样品分析

用0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS, p H=7.0 ）将牛血液稀释 1000 倍。CDs@MIP

的浓度为 1.4

g/L, 在样品中添加不同质量的 BHb, 测定溶液的荧光强度，并计算加标回收率。

3、结果与讨论

3.1 聚合物制备及表征

CDs@MIP

的制备过程如图1 所示。通过水热法制备具有强荧光的荧光碳点，然后采用 PEI 对

荧光碳点表面进行改性，以进一步提高碳点的荧光性能。在氨水存在下，采用溶胶-凝胶技术

在荧光碳点表面修饰硅层，然后以 APTES 为功能单体，牛血红蛋白模板分子通过非共价键结

合，得到的复合产物再与硅修饰碳点表面的交联剂 TEOS 反应，生成印迹聚合层。最后用

0.5%Tri 溶液洗脱聚合层中的模板蛋白，制得荧光印迹聚合物。

3.1.1 制备条件优化

通过改变 APTES 和TEOS 的用量考察功能单体和交联剂对荧光印迹聚合物性能的影响。如图

2A 所示，随着 APTES 量增加，CDs@MIP

的荧光强度逐渐降低，而 CDs@MIP

的荧光猝灭效

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摘要：

探究以荧光碳点为荧光源和载体制备了高选择性的荧光牛血红蛋白摘要：以荧光碳点为载体，3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，牛血红蛋白为模板分子，采用溶胶-凝胶法制备出对牛血红蛋白具有高选择性识别性能的新型荧光印迹聚合复合材料.采用红外光谱（IR）和扫描电子显微镜（SEM）对聚合物进行表征，结果表明，分子印迹聚合物包覆在荧光碳点表面，印迹因子为4.60.此对牛血红蛋白具有高选择性，相对于卵清蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白的选择因子分别为4.38、4.73和3.66.在最佳条件下，此对牛血红蛋白的响应线性范围为0.1~10.0μmol/L,检出限为23.0nmol/L.将此用于牛血液样...

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