双氧水预处理对氧化损伤的H9c2心肌细胞的保护机制
双氧水预处理对氧化损伤的 H9c2 心肌细胞的
保护机制
前言
心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion in-jury，MIRI）是指心肌缺血/缺氧一段
时间，当重新恢复血流或血氧供应后，心肌细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血/缺氧时
进一步加重、心功能进一步恶化的病理生理过程。细胞内既有活性氧等氧化系统，也存在清除
活性氧的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。在生理状态下，体
内的氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态，不会导致损伤。然而，缺血再灌注阶段会产生
大量活性氧，而机体又无法完全清除，这些过量的活性氧就会引起一些重要的生物大分子的氧
化损伤，从而诱导心肌细胞凋亡和坏死。目前认为活性氧介导的氧化损伤是引起心肌缺血再灌
注损伤的重要原因。
然而近年来大量研究表明，H2O2 预处理能保护 PC12 细胞抵抗氧化损伤，抑制氧化损伤导致的
细胞凋亡。Guo 等研究还发现活性氧可作为抗氧化酶第二信使激活级联反应，增加 SOD、CAT
等抗氧化酶活性，清除活性氧，从而起到抗氧化损伤的保护作用。对于氧化损伤的 H9c2 心肌
细胞，目前尚不清楚低浓度 H2O2 预处理是否具有保护作用以及能否上调抗氧化酶活性。本研
究通过构建大鼠 H9c2 心肌细胞氧化应激损伤模型，给予低浓度 H2O2 预处理，以探讨低浓度
H2O2 预处理对氧化损伤的 H9c2 心肌细胞的保护作用及其机制。目前，对于缺血再灌注损伤的
防治尚无有效办法，本研究在不改变损伤因子性质的情况下，通过适宜浓度的活性氧进行预处
理，激活机体自身的抗氧化防护机制，从而加强细胞对氧化损伤的抵抗能力，这种主动性抵抗
作用将为临床防治缺血再灌注损伤提供了一种新的思路。
1、材料与方法
1.1 材料
大鼠心肌细胞系（H9c2）购自中国科学院细胞中心。高糖 DMEM 为GIBCO 公司产品，胎牛血
清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258 购自 Sigma 公司，CCK8
试剂盒购自江苏碧云天公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒为南京建成
生物工程研究所产品，An-nexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒购自奥地利 Bender MedSys-tems 公
司，其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法和步骤
1.2.1 细胞培养和预处理方法将 H9c2 心肌细胞培养于含 15%胎牛血清的 DMEM 培养基中，在
37℃、5%CO2 培养箱中培养，选对数生长期的细胞进行实验研究。H2O2 预处理按以下步骤实
施：25μmol/LH2O2 作用 90 分钟后，换为含 15%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液继续培养
24h，PBS 漂洗 2遍，然后给予 2%FBS 的高糖 DMEM 稀释配置的400μmol/LH2O2 处理 6h。
1.2.2 丙二醛（MDA）测定收集四组细胞，分别用200μL 的1%Triton X-100 进行充分裂
解，15,000 转/分离心10min，收集上清，取100μL 上清，严格按照 MDA 试剂盒说明书操作，
测定各管吸光度，按照公式计算得出各组 MDA 含量。
1.2.3 总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定收集三组细胞，分别用200μL 的1%TritonX-100 进行充
分裂解，15,000 转/分，离心10min，取50μL 上清，严格按照 T-SOD 试剂盒说明书操作，BCA
法测定样品蛋白浓度，酶标仪检测各组吸光度，按照公式计算出各组的SOD 活性。
1.2.4CCK8 法检测细胞存活率将H9c2 心肌细胞按6×104/ml 接种于 96 孔板，每孔 100μL，细胞
融合生长至 80%左右，实验分组要求处理各组细胞，每孔加入10μL 的CCK8 液继续培养 2h，
在酶标仪 450nm 处，测定每孔的吸光度值，从而计算 H9c2 细胞的存活率。
1.2.5Hoechst33258 染色观察凋亡形态变化按照 5×104/ml 接种于 24 孔板，细胞融合生长至 60%
左右，经过相应处理，弃旧培养液，PBS 轻轻漂洗 1次，加入4%多聚甲醛固定 15 分钟，PBS
漂洗 1次，2.5μg/ml 的Hoechst 33258 室温避光染色 15 分钟，PBS 轻轻漂洗 3次，每次 5分
钟，然后每孔加400μLPBS 上荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.6Annexin-V/PI 双染色流式细胞仪检测凋亡率采用25cm2 培养瓶培养心肌细胞，细胞生长至
70%左右给予不同处理后，进行胰酶消化，离心收集细胞，4℃预冷无菌的PBS 漂洗细胞 2
遍，每组取总数为1×106/ml 的细胞待检测，用 250μL 结合缓冲液重悬细胞，并使其浓度为 2-
5×105/ml，取190μL 细胞悬液加入10μL 的Annexin V-FITC，间隔3分钟，再加入10μL 浓度为
20μg/ml 的碘化丙锭（PI），混匀后于室温避光孵育 15min，在流式反应管中加入400μLPBS，
轻轻混匀，上流式细胞仪检测分析。
1.3 统计学分析
采用SPSS17.0 统计软件，计量资料均采用x±s 表示。多样本均数比较采用单因素方差分析
(One-Way ANOVA)，两两间均数的多重比较采用LSD 检验，以 P<0.05 有统计学差异。
2、结果
2.1H2O2 预处理对氧化损伤 H9c2 细胞存活率的影响 400μmol/LH2O2 处理 H9c2 心肌细胞 6h，
造成H9c2 细胞的存活率降低至（60±5）%，与正常对照组（100%）相比，两者有显著性统计
学差异（P<0.05）。而应用 25μmol/LH2O2 预处理 90min 能明显对抗 400μmol/LH2O2 氧化损伤
降低细胞存活率的作用，能使细胞存活率提高到（85±7）%，与损伤组比较具有统计学差异
（P<0.05）。25μmol/LH2O2 处理 H9c2 细胞 90min 的细胞存活率为（98±2）%，与正常对照组
相比无统计学差异（图1）。
摘要：
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双氧水预处理对氧化损伤的H9c2心肌细胞的保护机制前言心肌缺血再灌注损伤（Myocardialischemiareperfusionin-jury，MIRI）是指心肌缺血/缺氧一段时间，当重新恢复血流或血氧供应后，心肌细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血/缺氧时进一步加重、心功能进一步恶化的病理生理过程。细胞内既有活性氧等氧化系统，也存在清除活性氧的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。在生理状态下，体内的氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态，不会导致损伤。然而，缺血再灌注阶段会产生大量活性氧，而机体又无法完全清除，这些过量的活性氧就会引起一些重要的生物大分子的氧化...
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分类：社科文学类资料
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