生物正交氧化还原体系的构建及意义

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生物正交氧化还原体系的构建及意义

细胞内代谢过程除以碳骨架结构改变为主的物质转化外，通常还伴随辅因子介导的能量转移。

物质转化和能量转移高度耦合，显着增加了代谢系统的复杂度。氧化还原辅因子通过在氧化

态和还原态之间循环再生传递电子，将物质转化途径关联成复杂的代谢网络[1]. 据不完全统

计，在微生物中仅吡啶核苷酸辅酶（nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate ），

NAD（P ））及其还原态参与的生化反应就超过 1000 种[2], 这还不包括它们参与的其他生物学

过程。传统生物化学研究提供了大量生物学元件[3,4],系统生物学研究建立了各种代谢模型

[5,6], 分子生物学发展提供了有效的遗传操作方法，使设计和构建新的高效、受控的物质转化

途径成为可能。然而，辅因子在代谢网络中的节点作用使各种生化反应建立起复杂的相互作

用网络，极大地影响了外源途径在底盘细胞代谢环境中的功能。以氧化还原代谢为例，新途

径可能破坏宿主内源氧化还原平衡，从而抑制生长，使新途径难以产生预期效果[7]. 人工构建

的外源途径对底盘细胞中天然代谢网络的相互干扰，特别是氧化还原环境的干扰，是影响外

源合成途径与底盘细胞适配性的重要因素。通过调节胞内辅因子水平，如控制酶的表达水

平、优化代谢途径、改造酶的辅因子偏好性以及敲除竞争代谢途径等，可以优化外源途径与底

盘细胞的适配性，在一定程度上提高代谢调控效率[8~10]. 但辅因子扰动的生物学效应的可控

性和可预见性低。例如，琥珀酸生产需要维持胞内较高 NADH 水平，但高 NADH 水平影响

菌株对培养条件的适应性[11]. 设计脂肪酸生产菌株时需要使脂肪酸合成途径与宿主 NADPH 供

给能力相匹配，但由于无法确定扰动 NADPH 水平对代谢造成的全局性影响，无法预测合适

的外源基因表达强度，需要筛选不同表达强度的启动子表达外源基因[12]. 辅因子关联作用导

致的复杂性也是限制代谢途径可移植性的重要因素。例如，在大肠杆菌（Escherichia coli）中

构建的高效丁醇合成途径, 移植到蓝细菌（Cyanobacteria）中就难以达到积累丁醇的效

果，因为蓝细菌倾向于积累 NADPH 而非 NADH[13,14].

因此，提高人工代谢途径在底盘细胞中的适配性、可预见性和可移植性需要降低代谢系统，

特别是辅因子依赖型氧化还原系统的复杂度。

　　 1　正交氧化还原体系

为降低代谢系统复杂度，可设计独立于生长代谢的合成途径及独立的辅因子循环再生体系。

这种在复杂代谢体系中执行系统子功能，并且其执行过程独立于系统其他组件的子系统称为正

“ ”交体系。正交体系的设计构建过程即正交化[15]. 正交氧化还原体系是指电子传递独立于系

统其他氧化还原辅因子系统的一种氧化还原体系。目前主要有两种策略可用于构建正交氧化还

“ ”原体系：（。在空间上分隔辅因子依赖型体系，即空间正交氧化还原体系� � ; （）��

“ ”构建利用人工辅因子代替天然辅因子的体系，即生物正交氧化还原体系 [8,15]. 设计构建正交

氧化还原体系，是减少外源途径对底盘细胞中天然代谢网络的干扰，提高外源合成途径与底

盘细胞适配性的重要策略。以下综述正交氧化还原体系的设计和应用特点。

　　 2　空间正交氧化还原体系

空正交化原体系通相的酶及因子限定在特定域，提高局部底物和因子间氧还过将关辅区辅浓

度、减少或避免与其他子系统的相互作用[16,17], 目前主要通过构建融合蛋白和设计蛋白锚定

支架实现，并已有多个成功应用的报道。另外，最近发现，细胞内可形成一些特殊的微区室

（microcompartment ），可以有效限制辅因子或代谢中间体扩散，从而避免胞内辅因子水平干

扰微区室内氧化还原代谢[18,19]. 利用微区室也可构建空间正交氧化还原体系[15].

蛋白融合技术通过基因工程手段将多个酶用短肽序列连接形成融合蛋白，通过调整连接肽特性

和酶的连接方向控制酶的空间定位（图1A ），优化级联催化过程中底物和能量传递[20]. 蛋白

锚定支架技术通过调整支架上的锚定位点距离、各种锚定位点的数量和连接肽特性 3 种方式调

整酶的空间定位和比例（图1B ），可降低代谢网络对目标途径的影响，提高目标途径底物和

辅因子的局部浓度，减少与环境的相互影响[21].

两种空间正交氧化还原体系构建策略都受到连接肽特性的影响，由于连接肽及蛋白结构和功能

的多样性，需要通过筛选确定合适的连接肽柔性和长度，优化酶的空间定位[2,22]. 连接肽通

常使用柔性序列 GGGGS（G4S）[23~26], 通过调整其拷贝数改变连接肽长度，但有时利用刚

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摘要：

生物正交氧化还原体系的构建及意义细胞内代谢过程除以碳骨架结构改变为主的物质转化外，通常还伴随辅因子介导的能量转移。物质转化和能量转移高度耦合，显着增加了代谢系统的复杂度。氧化还原辅因子通过在氧化态和还原态之间循环再生传递电子，将物质转化途径关联成复杂的代谢网络[1].据不完全统计，在微生物中仅吡啶核苷酸辅酶（nicotinamideadeninedinucleotide（phosphate），NAD（P））及其还原态参与的生化反应就超过1000种[2],这还不包括它们参与的其他生物学过程。传统生物化学研究提供了大量生物学元件[3,4],系统生物学研究建立了各种代谢模型[5,6],分子生物学发展...

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