RNA干扰转基因植物的研发现状

3.0 闻远设计 2024-04-20 126 4 116.94KB 9 页免费

侵权投诉

RNA 干扰转基因植物的研发现状

　摘要：RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发

同源 mRNA 高效特异性降解的现象，在真核生物中普遍存在且进化保守。RNAi 技术作为 21 世

纪初的重大科学成就，目前被广泛应用于疾病防治、基因功能研究、植物改良育种等领

域。RNAi 技术常与转基因技术结合用于植物改良育种，通过不同的载体设计或作用途径来研

发满足生产需要的农业生物技术产品。为了明确现阶段基于 RNAi 技术的转基因植物育种技术

进展，综述了 RNAi 现象的发现和作用机制、转基因载体设计、小 RNA(small RNA,sRNA)的递

送方式等方面的研究进展，并阐述了基于 RNAi 技术的转基因植物的研究实例和商业化情况，

以期为相关研究提供参考，从而发挥 RNAi 技术的最大应用价值，使之服务于新时代的农业发

展。

Progress on RNAi-based Transgenic Plants

HUANG Chunmeng ZHU Pengyu WANG Zhi WANG Chenguang DU Zhixin WEI Shuang ZHANG

Yongjiang FU Wei

Chinese Academy of Inspection and Quarantine College of Plant Protection,China Agricultural

University Nanning Customs Technology Center Guangzhou Customs Technology Center

　 Abstract：RNA interference( RNAi) refers to the phenomenon of high-efficiency and specific

degradation of homologous mRNA induced by double-stranded RNA( dsRNA),which is ubiquitous

and evolutionarily conserved in eukaryotes. RNAi technology,as a major scientific achievement at the

beginning of the 21 st century,is currently widely used in disease prevention,gene function

research,plant improvement and breeding and other fields. RNAi technology is often combined with

transgenic technology for plant improvement and breeding,and agricultural biotechnology products

satisfying production needs are created through different vector designs or action pathways. In order to

clarify the progress on breeding technology of transgenic plants based on RNAi technology,the

research progress of the discovery and mechanism of RNAi phenomenon,the design of transgenic

vectors and the delivery methods of small RNA( sRNA) were reviewed. And the research examples

and commercialization of transgenic plants based on RNAi technology were also elaborated,with a

view to providing reference for related research,thus exerting the maximum application value of RNAi

technology and serving the agricultural development in the new era.

进入 21 世纪以来，生物领域发展十分迅速，然而，我们仍然面临着许多复杂的挑战，其中包

括在保持环境质量的同时保障人口迅速增长所带来的对粮食的需求。这不仅需要最大程度减少

作物病虫害，也需要利用现代生物技术改进现有植物特性，特别是提高作物产量和抗逆性以适

应气候变化。满足这些需求离不开包括 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术在内的转基因技

术、基因编辑技术以及合成生物学技术[1]。RNAi 转基因植物是指基于 RNAi 技术，通过导入

受体植物外源片段产生双链 RNA(double strand RNA,dsRNA)并被加工成小 RNA(small

RNA,sRNA)，进而引发与之互补的特定靶基因表达下降或沉默，从而获得的可用于农业生产或

农产品加工的植物及其产品。目前，国内外研发人员已经利用 RNAi 技术开发出具备有害生物

抗性、品质改良、有害物质减少等不同优良性状的生物技术产品。本文基于 RNAi 现象的发现

和作用原理，阐述了 RNAi 转基因植物的设计、dsRNA 或小干扰 RNA(small interfering

RNA,siRNA)的递送方式，并列举了 RNAi 转基因植物的研究实例以及全球部分商业化的 RNAi

转基因植物信息，旨在为 RNAi 技术的应用提供参考，以期能够充分利用 RNAi 技术助力发展

高效绿色友好型农业。

　　 1　RNAi 的发现和作用机制

1.1 RNAi 现象的发现

RNA 沉默是由小分子非编码RNA(20～30nt)引导的，包括多种沉默机制，如RNA 降解、翻译

抑制、染色质调控以及 DNA 缺失[2]，几乎每个真核生物都存在某种形式的 RNA 沉默[3]。以

siRNA 和微小RNA(microRNA,miRNA)为主的各种类型的小 RNA 分子已得到鉴定并被证明参

与了真核生物复杂的生命活动调控。如自然产生的反义 RNA(antisense RNA)被发现参与了原核

生物的 DNA 复制、RNA 转录和翻译后调控[4]，反义 RNA 通过与靶向mRNA 杂交来抑制内源

基因，由此产生的结构可能会阻碍细胞核的加工、细胞质输出，导致翻译抑制，进而使靶基因

的mRNA 快速降解[5]。而且，共抑制表达的正义 RNA(sense RNA)与反义 RNA 一样，对靶基

因同样具有抑制作用[6]。此外，在一个位点上的多拷贝转基因有可能会导致转录后基因沉默

(post-transcriptional gene silencing,PTGS) “。异常 RNA”的概念被引入作为 RNA 过丰度的结果，

这些异常转录物可以用作引物，通过植物编码的RNA 依赖的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA

polymerase,RdRp)来转化 RNA 或反义 RNA，最终导致RNA 降解[7]。这个概念同样适用于转基

因重复序列易引发基因沉默的现象，转基因重复序列无论转录程度高低，都会直接导致RNA

产物的异常从而触发RNA 过丰度途径，因为转移DNA(transfer DNA,T-DNA)的插入往往导致

直接重复(direct repeat,DR)或者倒置重复(inverted repeat,IR)，而早期在马铃薯和矮牵牛花中的研

究表明转基因低水平的表达与倒置重复紧密相关[8] 。

同时，转基因重复也被认为涉及转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)。然而，

这个过程需要内源性 RdRp 的存在，第一种植物编码RdRp 在番茄中被发现，随后发现其在核

糖核酸酶(ribonuclease,RNase)Ⅲ 家族的Dicer 酶或Dicer 类似蛋白(Dicer like protein,DCL)作用下

的产物是一种新的短单链RNA，被称为siRNAs[9]。siRNA 在dsRNA 和同源 RNA 的引导降解

之间提供了联系。其实早在1991 年，Cameron 和Jennings[10]在观察到动物培养细胞的同源转

基因可使转基因发生沉默后，便提出 dsRNA 可能参与同源性基因沉默的设想。1998 年，Fire

等[11]在研究秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)时首次证明dsRNA 是基因沉默的最主要的诱

发因子，推测在植物中也存在类似机制，并将这种由 dsRNA 引发的抑制特定基因表达的现象

称为RNAi 。

除了这种典型的RNAi 机制，还存在由动植物自身产生的 miRNA 调控基因表达的现象。1993

年，研究者首次在线虫中发现 miRNA 途径，并在 2000 年被鉴定为 Let-7miRNA，同时发现这

种保守途径在线虫和哺乳动物中均存在[12]，主要通过翻译抑制和/或降解同源 mRNA 来调节基

因的表达。2001 年首次报道了在哺乳动物细胞中采用RNAi 技术抑制内源基因表达[13]，进一

步发展了 RNAi 技术的应用领域和方向，随后 RNAi 技术逐步应用于疾病治疗、基因功能研究

和植物育种等领域。

1.2 RNAi 的作用机制

在植物中，RNA 沉默是一种抵御病毒、转座子和重复基因组等核酸入侵的防御机制，通常在

转录后水平、转录水平、翻译起始水平调控基因表达。RNAi 的核心机制分为 3个阶段(图

1):RNaseⅢDicer 酶将长dsRNA 切割为siRNA 双链体;选择 siRNA 双链体中的 1条链，并将其装

载到一种由 Argonaute 蛋白(AGO)组成的 RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing

complex,RISC);siRNA 引导 RISC 识别并切割同源 mRNA[14]。在某些物种中，RNAi 还涉及

RdRp,RdRp 可以利用异常 RNA 或同源 mRNA 合成 dsRNA，进一步参与到RNAi 次级沉默信号

扩大过程中[14] 。

图1 RNAi 机制示意图[14]

PTGS 途径常常由转基因或病毒入侵引起，称为外源 RNA 沉默途径，分为倒置重复途径(IR-

PTGS)和正义途径(S-PTGS)。IR-PTGS 途径首先形成IR 转录产物 dsRNA,DCL4 将dsRNA 加工

成21 nt 的siRNA，经 3'端甲基化转移酶 HEN1 甲基化修饰[15]，装载到AGO 蛋白形成RISC，

在引导链 RNA 的引导下对同源 mRNA 进行切割降解。而 S-PTGS 途径主要负责异常 RNA 的降

解。异常 RNA 分子通常缺少3'端polyA 尾巴或5'端帽子，它们被认为是来源于高丰度的转基因

正义/反义 RNA、病毒RNA 、截短型转录本以及复杂的基因插入、基因重复区域等。

TGS 途径与 PTGS 途径具有共同的作用底物，并且都是通过靶向同源 mRNA 导致DNA 甲基

化，最终阻碍 DNA 转录。RNA 介导的 DNA 甲基化(RNA-directed DNA methylation,RdDM)实际

上是第一个发现的由 sRNA 控制的表观遗传机制。RdDM 最初是在烟草植物中发现的，在存在

病毒自主以RNA 为模板进行RNA 复制的情况下，其 RNA 被反转录成cDNA，并整合到基因

组中的类病毒cDNA 被特异性甲基化[16]。研究表明，与启动子区域互补的 dsRNA 可以诱导启

动子甲基化和转录沉默[17]。RdDM 由不同类型的序列诱导，有不同的靶标，常利用 2种类型

的dsRNA 作为甲基化诱导物:具有反向重复序列的转基因发夹结构和dsRNA 病毒[18]。RdDM

不仅是控制重复序列和病毒入侵的响应机制，也是调控基因表达的调节网络的一部分。

除了siRNA 所引起的RNA 沉默现象，miRNA 介导AGO1 进行的靶基因切割也是一种重要的功

能基因沉默模式，这在 AGO1 突变体互补实验中得到了证明。类似于其他真核生物，在

miRNA 的引导下，AGO1 从mRNA 碱基配对序列的中间进行切割[19]，使被切割的mRNA 暴

露1个游离的 5'端片段和 1个3'羟基，再从3'端片段引发裂解，切割片段由末端尿苷酸转移酶

HESO1 在3' 端对其进行尿酰化，最终降解。

植物的 miRNA-靶基因相互作用并不总是导致AGO 切割，也有可能导致翻译抑制。目前对植物

miRNA 介导的翻译抑制的分子机制的研究程度不如动物，但是二者存在相似之处。除2种常见

的转录后调控模式外，植物 miRNA 也可以进入到RdDM 机制中。在这种情况下，miRNA 前体

将由DCL 3 处理产生较长的片段(24 nt)，并被装载到AGO4/6/9 系统以引导 DNA 序列发生甲基

化修饰，进而在转录水平调控基因表达[20]。目前已在水稻中发现了这类miRNA 的具体实例，

其中有一类 miRNAs 由DCL3 处理，装载到AGO4 上引导 DNA 甲基化[21] 。

　　 2　RNAi 转基因植物的研发现状

RNAi 技术应用于植物育种多采用外源导入 T-DNA 的方式，将正义 RNA、反义 RNA 或者倒置

重复的靶基因序列放置于选定的启动子下形成dsRNA，并进一步加工成 siRNA 进入 RNAi 途径

以调控植物发育，从而达到育种目的。此外，也有人工 miRNA 的途径和利用 Rd DM 的途径，

后者能够对靶基因的启动子进行表观遗传修饰从而调控靶基因表达以改变植物农艺性状。本文

从转基因设计、sRNA 递送方式、RNAi 转基因植物的研究实例 3个角度来阐述 RNAi 转基因植

物的研发现状。

2.1 RNAi 转基因设计

2.1.1 正义或反义 RNA

通过共表达 mRNA 靶标的正义和反义转录本，引入用于植物沉默的转基因 dsRNA。该方法依

赖于由 2个独立转录的互补 RNA 杂交获得的用于 RNA 沉默的 dsRNA。尽管与单独使用反义转

录物相比，该方法的效率并未显著提高，且远小于使用 IR 的方法[22]。但是，正义和反义转录

本可以在相反的启动子之间进行聚合转录，这种设计缩短了所需的 T-DNA 的长度，并避免重

复使用序列。通过锥虫和果蝇的转基因实验证实了存在通过聚合转录的RNAi 介导的基因抑制

[23] 。

2.1.2 内含子嵌入的倒置重复序列

有时为了获得理想的表型，将内含子整合进反向重复区域作为一个保守的调控元件来保证基因

时空特异性的表达和抑制。最常用的 RNA 沉默转基因结构是包含1个由间隔序列分隔的倒置

重复 IR 序列。经过转录IR 序列形成dsRNA 并被加工成为成熟siRNA 以有效地沉默靶基因。

间隔序列可以是与靶标无关的任何序列，使用内含子衍生的可插入间隔可以增加沉默效率

[24]。除了植物，基因内含子衍生的人工短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)也能在哺乳动

物细胞中诱导基因沉默[25]。有时在育种中追求更加理想的表型性状，会在表达一个基因的同

时抑制另一个基因的表达。在高赖氨酸表型的基因工程玉米中，表达赖氨酸反馈不敏感的生物

合成酶CordapA 而抑制内源赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶(lysine ketoglutarate

reductase/yeastine dehydrogenase,LKR/SDH)累积可以最大程度地提高成熟籽粒中游离赖氨酸的

积累，从而获得高赖氨酸含量的玉米品种[26]，在这个高赖氨酸含量的玉米中，抑制内源基因

的设计则是采用插入内含子的倒置重复序列。

2.1.3 人工 miRNA

内源性 miRNA 序列可以被设计成人工 miRNA(artificial miRNA,AmiRNA)。AmiRNA 首次被报

道是在人的细胞系中，内源性 miRNA 前体经修饰产生 AmiRNA，从而选择性抑制互补靶序列

[27]。在哺乳动物细胞中，尽管 RNAi 已经被证明是有效的，但dsRNA 用于 RNA 沉默的途径

是有限的。除少数胚胎细胞培养系统外，dsRNA 还可诱导翻译抑制[28]。因此，由动物miRNA

前体产生的 shRNAs 常被用于沉默动物系统中的内源性基因[29]。现有的研究已经给出使 sRNA

有效的发挥 RNA 沉默作用的途径和原则:在动物miRNAs 中，来自5'端的第2～8位(种子区)的

核苷酸位置可能是靶特异性的最重要的决定因素[30];sRNA 双链中更倾向于将5'端处于不稳定

状态的链装载到RISC[31];GC 含量在 30%～50%为佳[32];具有 5-尿苷的sRNA 可优先装载到

AGO1[33]。同样地，miRNAs 也能抑制报告基因和内源性基因在植物中的表达[34]。有学者基

文档加载中……请稍候！
如果长时间未打开，您也可以点击刷新试试。

下载文档到电脑，查找使用更方便

免费 4人已下载

立即下载

摘要：

RNA干扰转基因植物的研发现状　摘要：RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解的现象，在真核生物中普遍存在且进化保守。RNAi技术作为21世纪初的重大科学成就，目前被广泛应用于疾病防治、基因功能研究、植物改良育种等领域。RNAi技术常与转基因技术结合用于植物改良育种，通过不同的载体设计或作用途径来研发满足生产需要的农业生物技术产品。为了明确现阶段基于RNAi技术的转基因植物育种技术进展，综述了RNAi现象的发现和作用机制、转基因载体设计、小RNA(smallRNA,sRNA)的递送方...

展开>> 收起<<

RNA干扰转基因植物的研发现状.docx

共9页,预览3页

还剩页未读，继续阅读

RNA干扰转基因植物的研发现状

相关推荐

开通VIP享超值会员特权

作者详情

相关内容

推荐作者

热门标签

举报选择: