dPCR技术的原理及其应用研究

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dPCR 技术的原理及其应用研究

　摘　　　　要：　随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化，用于核酸检测的各种 PCR 衍

生技术应运而生。数字 PCR 是一种单分子水平的大规模分区扩增定量核酸检测技术。该技术

以微腔室/微孔或微滴作为 PCR 反应器，无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品初始浓度

的绝对定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确度的特点。本文详细介绍了数字 PCR 的技术

发展史、作用原理以及仪器平台类型，系统阐述了数字 PCR 在转基因检测、疾病诊断、环境

及食品监管等方面的应用概况，并对该技术的应用前景进行了展望，以期对未来数字 PCR 的

开发利用提供参考。

　　　　　　 Abstract 　：Various　derivative　technologies　based　on　PCR　for　nucleic　acid　detection　

have　emerged　with　the　continuous　development　and　the　diverse　needs　of　molecular　biology　

technology.　Digital　PCR(dPCR)　is　a　nucleic　acid　detection　method　for　large　scale　amplification　based　

on　a　single　molecular　template,　which　runs　an　individual　PCR　reaction　using　chambers/wells　or　

droplets.　dPCR　can　be　used　for　absolute　quantification　for　the　initial　concentration　of　samples　without　

calibrator　and　drawing　standard　curve,　showing　the　characteristics　of　high　sensitivity,　specificity,　and　

accuracy.　In　this　review,　we　introduce　the　history　of　technology　development,　principle,　and　

instrument　platform　types　of　digital　PCR　in　detail.　Then,　we　summarize　the　application　of　this　

technology　in　GMO　quantification,　disease　diagnosis,　environment　and　food　supervision.　Finally,　we　

describe　the　application　prospect　of　dPCR,　providing　a　reference　for　the　development　and　utilization　

of　this　technology　in　the　future.

　　　 Keyword：　 digital　PCR;　single　molecule;　absolute　quantification;

自1983 年Kary　Mullis 等发明 PCR 这一革命性技术以来，这种核酸分析方法以其简便、直观、

经济、快捷等特性在检测领域一直占据主导地位[1]。随着分子生物学技术的不断发展和需求的

多样化，基于普通 PCR 的各种衍生技术应运而生。PCR 技术已不仅仅局限于对靶基因进行体

外无限扩增，而是由定性转向了更为精确的定量。1992 年，Higuchi 等[2]最早提出了实时荧光

定量 PCR(real　time　quantitative　polymerase　chain　reaction,qPCR)的设想。qPCR 通过在 PCR 反应

体系中加入荧光基团，实时监测整个 PCR 进程中荧光信号的积累，最后利用标准曲线对未知

模板进行定量分析。此后，qPCR 被广泛应用于临床诊断、生物育种、食品安全检测和法医鉴

定等领域。但 qPCR 依赖于阈值循环数(Ct 值)和校准物，受样品中抑制剂影响较大，无法准确

检测低丰度样品，这在一定程度上制约了其使用。数字 PCR(digital　polymerase　chain　

reaction,dPCR)作为 DNA 定量的新技术在一定程度上弥补了 qPCR 的不足，无需校准物和绘制

标准曲线即可实现对样品初始浓度的绝对定量，比传统 qPCR 具有更加出色的灵敏度、特异性

和精确性。该技术正在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一

代测序(next-generation　sequencing,NGS)文库精确定量和结果验证等方面逐渐发挥重要作用

[3,4,5,6,7,8]。

　 1　、dPCR 技术的发展

dPCR 从研发起始到广泛应用经历了较长的时间跨度。1992 年，Sykes 等[9]报道了一种基于极

限稀释、PCR 和泊松数据统计来定量样本初始目标总数的方法。该研究在检测复杂背景下低丰

度重链突变基因 IgH 时，将待检样品进行了极限稀释使每个反应孔中仅含单个模板分子，PCR

“扩增结束后统计信号，以此获得准确的起始分子数量。该研究虽未明确提出数字 PCR”的概

念，但建立了dPCR 的基本实验流程：从极限稀释-PCR-泊松数据统计；确定了 dPCR 检测中一

—— “ ”个极其重要的原则以终点信号有无作为定量方法，形成了 dPCR 的雏形[10]。1997

年，Kalinina 等[11]使用纳升体积的石英玻璃毛细管进行单克隆模板 PCR 扩增，根据荧光探针

收集每管内单分子信号，该研究发展了单分子定量技术。1999 年，Vogelstein 和Kinzler[12]在

检测和定量直肠癌患者粪便样品中 K-RAS 基因突变时，手动将基因组DNA 样品稀释并等分至

384 孔板中，待PCR 扩增结束后以野生型或突变型探针杂交，结果显示 100 多个含有基因组

DNA 的反应孔中，只有4个反应孔显示基因突变。该研究不仅成功开发了一种癌症诊断方法，

“而且首次正式提出了数字 PCR”的概念，认为若采用更多孔板可使检测灵敏度更高，指明了

dPCR 的发展方向。但是在这一时期，dPCR 操作复杂，耗费人工，难以大规模开展。2003

年，Dressman 等[13] “设计了一个称之为BEAMing”的实验方案，以一种类似于流式的磁珠乳液

扩增方法，将模板、引物、PCR 试剂和磁珠的混合物分散至液滴中，大多数液滴不含或含有1

个模板，PCR –完成后，扩增产物通过生物素链霉亲和素连接到磁珠上，随后珠子被打破，探

针与扩增产物杂交，通过流式细胞仪读取结果。该技术不仅替代了手工在微孔板中进行样品分

散的操作，而且将每个油包水乳化的小液滴变成了 PCR 反应器，其数量可以达到100,000。该

技术建立了基于液滴的数字 PCR 的工作原理，将数字 PCR 的研究又推进了一步[14]。虽然研究

人员一直致力于对数字 PCR 的操作简化和检测便捷进行优化，但范围多局限在实验室内进

行，商业化进程则是非常缓慢。直到2006 年，美国 Fluidigm 公司研制并推出第一台基于芯片

的商业化数字 PCR 系统；美国 Quantalife 公司研制出最早的微滴式数字 PCR 平台。此后，多家

国内外公司继续研发推出各种数字 PCR 平台并投入使用。

　 2　、dPCR 技术的原理及仪器分类

　　　 2.1 　、dPCR 作用原理

dPCR 的作用原理是将含有核酸分子的反应体系进行极限稀释，通过控制阀门或微滴生成器分

散成为体积可小至皮升级的反应单元，每个反应单元作为一个独立的PCR 反应器，其中含有

或不含待检靶标分子(DNA 或RNA)，在 PCR 扩增结束之后，采集每个反应单元信号，并以终

点信号的有无作为判断标准( “有荧光信号的液滴判读为1” “，无荧光信号的微滴判读为0”)，最

后根据泊松分布（Poisson　distribution）原理计算待检靶标分子的浓度或拷贝数(图1)。

　 2.2　、dPCR 数据分析与统计假设

在通常情况下，dPCR 每个反应单元中可能包含 2个或 2个以上的目标分子，因此，在 dPCR 统

计分析中引入了泊松统计方法进行数据的校准。泊松分布是一种离散概率分布，是指在固定的

时间或空间内发生给定事件的概率，假定事件以固定的平均速率发生，并与上一次以来的事件

无关。泊松概率分布公式如下：

其中是确定观察到目标分子的概率，λ是每个反应单元内平均目标数，是反应单元内实际存在

目标分子数。d　PCR 结果分析是基于以下假设：即目标序列在反应单元内的分布是近乎完美的

泊松过程。设定 P为阳性反应单元数目，N为总反应单元数目，VP 为单个反应单元体积，D

为模板稀释因子，每微升样品中 DNA 拷贝数计算公式见如下[15,16]:

置信区间(confidence　interval)是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，

一个概率样本的置信区间是对这个样本的某个总体参数的区间估计。在各平台的仪器设置中，

一般选择泊松分布95%的置信区间计算误差线。

　 2.3 　、dPCR 仪的分类

目前，dPCR 的广泛应用归因于样品分散问题这一关键制约因素的成功解决。纳米加工及微电

子技术发展使得高通量分散样品并获得均匀反应单元成为可能。目前市场上使用的数字 PCR

仪根据样品分散方式可分为两大类：(1)基于微流控芯片数字 PCR 仪。此类平台又分为封闭式

(美国 Fluidigm 公司 BioMark 以及美国 Formulatrix 公司 Constellation 系统)和开放式(美国

ThermoFisher 公司 Quant　Studio)两种平台。封闭式平台是在硅片或石英玻璃上光刻多个微管或

微腔室，通过不同的阀门控制溶液的流动，实现样品制备、反应、分离和检测[3]；开放式平台

是以超高密度亲疏水微孔芯片作为反应载体，芯片表面被处理成疏水，而微孔内部为亲水，这

种亲疏水结合的方式可使样品及反应体系轻易进入微孔而不会停留在表面，从而形成密集的独

立微反应室并避免了各反应之间的交叉污染[17,18,19]。(2)基于油包水技术的微滴数字 PCR 平

台(美国 Bio-Rad 公司 QX100、QX200 和RainDrop 系列，中国锐讯生物公司 DropX-2000、小海

龟BioDigital 以及法国Stilla　Technologies 公司 Naica　System)。该平台通过液滴发生器将乳化液

滴分散成大小均一的液滴反应单元，样品分散过程中的破裂容易造成假阳性，而且分散通道的

堵塞问题也是一个关注的重点。相对于基于芯片的数字 PCR 仪，微滴数字 PCR 仪价格更为低

廉。各种仪器的详细信息见表1所示。

图1　数字 PCR 的作用原理

表1　dPCR 仪比较

根据参考文献[20,21]汇总修改。

　 2.3.1　、基于反应室的方法

基于反应室的数字 PCR(chamber-based　digital　PCR,cdPCR)工作流程是将预先混合的PCR 反应液

通过微流控技术生成乳化液滴并注入预制的固态隔板(室)进行样品分散，然后移至专用热循环

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摘要：

dPCR技术的原理及其应用研究　摘　　　　要：　随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化，用于核酸检测的各种PCR衍生技术应运而生。数字PCR是一种单分子水平的大规模分区扩增定量核酸检测技术。该技术以微腔室/微孔或微滴作为PCR反应器，无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品初始浓度的绝对定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确度的特点。本文详细介绍了数字PCR的技术发展史、作用原理以及仪器平台类型，系统阐述了数字PCR在转基因检测、疾病诊断、环境及食品监管等方面的应用概况，并对该技术的应用前景进行了展望，以期对未来数字PCR的开发利用提供参考。　　　　　　Abstract　：Various　de...

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