dPCR的原理及在生物学检测中的运用

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dPCR 的原理及在生物学检测中的运用

　　摘　　　　　要：数字 PCR (digital PCR, dPCR)是在普通 PCR 和定量 PCR 基础上发展的第三代

PCR 技术，通过有限稀释和泊松分布统计实现精确的绝对定量检测。相比于前两代 PCR 技

术，dPCR 能够实现 DNA 模板的绝对定量且对 PCR 抑制剂具有更强的耐受性。目前，该技术

在致病菌和病毒、基因突变、甲基化 DNA、转基因成分和食品掺假的检测中都得到了广泛的

应用。该文介绍了 dPCR 的原理并综述了其在生物学检测中应用的研究进展，以期为基于

dPCR 的检测方法的开发和应用提供参考和依据。

　　　 Abstract 　：Digital PCR(dPCR) is a third-generation PCR technology based on

conventional PCR and quantitative PCR, which applies finite dilution and poisson statistics to achieve

accurate absolute quantitative detection. Compared to the previous two generations of PCR

technology, dPCR can achieve absolute quantification of DNA template and shows better tolerance to

PCR inhibitors. At present, dPCR has been widely used in detection of pathogenic bacteria, viruses,

genetic mutations, methylated DNA, genetically modified ingredients and food adulteration. This

review introduces the principle of dPCR, summarizes its progress in biological detection area, with the

aim to provide references for development and further application of dPCR.

　　 Keyword： digital PCR; biological detection; absolute quantitative detection;

近年来，分子生物学技术发展迅速，尤其是基于 PCR 衍生出的一系列技术，因其具有操作简

单、快速准确、特异性强且灵敏度高的特点，已被广泛应用于各种检测领域。1983 年，美国

KB Mullis 教授发明了 PCR 技术用于核酸检测，其被称为第一代 PCR[1]。随后 PCR 技术出现

井喷式发展，1992 年科学家们在第一代 PCR 技术的基础上引入荧光化学物质，发明了定量

PCR 技术(quantitative PCR,q PCR)[2]：通过荧光信号的变化对整个 PCR 过程进行实时监控，最

后通过循环阈值(cycle threshold,Ct)和标准曲线对待测样本进行定量检测。数字 PCR (digital

PCR,d PCR)技术是近年来广泛应用于检测的第三代 PCR 技术。区别于 q PCR 依赖校准曲线对

靶基因定量的策略，该技术通过将 PCR 体系分散成无数个小体积的反应单元进行扩增，允许

单拷贝 DNA 的检测，可以实现对核酸的绝对定量。每个小反应单元含有少量或者没有目标序

列，这有助于降低样本中的多种抑制剂的干扰和 PCR 体系中模板之间的竞争效应。自 1999 年

Vogelstein 和Kinzler[3]第一次阐述 d PCR 方法用于基因突变的检测之后，该方法便在各个检测

领域陆续得到广泛应用并发展。表 1总结了三代 PCR 技术的特点及其应用范围。

表1 PCR 技术的比较

　 1 　、d　PCR 的原理

d PCR 的原理是通过有限稀释将含有目的 DNA 的PCR 反应体系分散成无数个单一模板的 PCR

体系进行扩增，再通过统计检测结果及泊松分布校正实现目的 DNA 的绝对定量(图1)。

d PCR 包括三个步骤：分散体系、PCR 扩增和信号检测。通过样品的稀释和分散形成分散体

系，这一步是限制 d PCR 发展应用的一个重要因素，其所引起的分散数量和分散体积的不同极

大地影响着定量结果的精度与准确性。分散体系的形成增加了靶分子的有效浓度，并在一定程

度上对存在干扰的复杂化合物进行了纯化，提高了靶分子和背景之间的比率[24]。基于 d PCR

统计的定量方式，反应体系的分散数量越多，低浓度靶分子的检测可能性就越大，检测灵敏度

就越高，同时多个单一的反应单元也为多目标序列的高通量检测的发展提供了基础。此外，分

散体积的不同会对拷贝数结果的测量产生影响，是造成d PCR 精度下降的一个潜在因素，且与

检测限的大小形成反比关系。

然而，在 d PCR 发展早期，使用96 孔板或 384 孔板作为单一样品的分散反应载体，其分散程

度低、分区数量少，无论是时间和试剂耗材成本，还是检测精确度，都无法满足实际应用的要

求。微流体技术和乳液化学的引入为样品分散问题的解决提供了良好的动力。目前已成功应用

于商业化的 d PCR 系统根据分散方式的不同可分为三种主要类型：基于油包水微滴生成技术的

微滴式数字 PCR (droplet digital PCR,dd PCR)、基于微孔芯片的微孔板数字 PCR (micro-chamber

digital PCR,md PCR)和基于微流控技术的微流控芯片式数字 PCR (microfluidic chip digital

PCR,mcd PCR)(表2)。另外，基于水凝胶珠、琼脂糖珠和生物打印技术等样本分散方式的 d

PCR 虽然尚未商业化，但在现有的实验研究中已取得一定进展。微滴式通过油包裹PCR 体系

形成无数个油包水微滴，每个微滴是一个独立的反应单元，这种特殊的微滴在进行 PCR 时能

够保证完整的形态，不会互相扩散[25]，也阻止 PCR 混合物液滴在热扩增过程的蒸发；微孔芯

片式是利用光刻技术在硅基上刻蚀出微孔阵列，再通过表面改性、打磨等操作形成数万个纳升

级的表面疏水和孔内壁亲水的微反应室；微流控芯片式则是利用微流控芯片装置使 PCR 反应

体系准确快速地分散于芯片孔中，而每个孔都是一个小反应体系(纳升级)[26]。md PCR 操作简

单快速，只需一步便可形成均匀分散样品，亲疏水结合的设计使样品不会停留在芯片，从而避

免了各反应室的交叉污染，且表面相邻反应之间存在固态隔板，不容易产生假阳性结果，而dd

PCR 中液滴之间的液体屏障在液滴转移或热扩增过程中存在破碎的风险[27]。dd PCR 利用油包

水形成液滴，制备难度低、易实现高通量检测，但是在进行分液及转移到反应孔时有部分死体

积，会造成检测结果偏差[28]；而 mcd PCR 是通过微流控芯片将反应分配到反应孔中，其对仪

器性能要求不高，容易推广使用。相比较于 dd PCR,mcd PCR 有效避免了其分散通道容易堵塞

的问题，但其价格更贵，检测通量低，无法满足大批量样品的同时检测。同时，mcd PCR 的分

区数量通常少于 dd PCR，这导致其检测的动态范围相对更低[29]。进行 PCR 扩增时，微滴式

是通过将分散好的PCR 体系移入到 96 孔板中，然后在普通的 PCR 仪上进行扩增即可，而芯片

式则需要通过特定的仪器进行扩增。

图1 数字 PCR 的原理

关于信号检测，目前主要有光电倍增管(photomultiplier,PMT)、硅光电子计数器(multi-pixel

photon counter,MPPC)、电荷耦合器件(charge-coupled device,CCD)、互补金属氧化物半导体

(complementary metal oxide semiconductor,CMOS)、扫描器等 5种高分辨率的图像处理策略

[30]。对于不同的分散方式，合适的光学检测系统的选择直接关系到定量检测结果的精度、灵

敏度。dd PCR 基于液滴的荧光信号计数，需要将 96 孔板放在液滴读取仪中，适合采用PMT/硅

光电子计数器对每个微滴进行信号分析，最后经过软件处理输出拷贝数。PMT 技术虽然抗干扰

能力强，但一次只能处理一个液滴，不适合于高通量的定量检测，其相应的激光光源和软件也

相对昂贵[31]。而基于水凝胶珠、琼脂糖珠、生物打印技术、微孔芯片和微流控芯片等的d

PCR 一般是通过使用扫描设备，如CCD、CMOS 等，对芯片的荧光点信号进行捕捉，然后通

过读取荧光信号进行分析，最终得出拷贝数。基于扫描方式的荧光系统可以一次性扫描整个反

应平台，但其检测时间却主要取决于定量过程中使用的图像处理算法[30,31]。

d PCR 定量计数的方法相较于传统q PCR 的定量方法更为简单，无需建立标准曲线和计算反应

的扩增效率等繁琐步骤，而是通过直接计数的方式得出检测结果。在进行 PCR 扩增反应后，

将有荧光信号(阳性) “的标记1”，没有荧光信号(阴性) “的标记0”，以此进行信号的统计计算。但

在理想条件下一个反应单元最多含有一个目标物，而实际操作中 d PCR 有阳性信号的反应单元

可能不止一个目标物，所以根据阳性信号数量进行统计计算时，所得的最终结果不是真实的目

标DNA 分子拷贝数存在着一定的可能性，因此需要通过泊松分布概率公式对反应的结果进行

校正计算[6,7]。在该公式中，λ表示每个反应单元包含靶 DNA 分子的平均拷贝数，p表示在一

定的 λ条件下每个反应单元中含有 i拷贝靶 DNA 分子的概率。当样品 DNA 稀释倍数m一定

时，λ的大小也就一定，即λ=cm,c 是目的 DNA 原始拷贝数量。当i值为 0时，即没有阳性信号

的微孔的概率 p=e-λ，而,n 是反应的总微孔数，f是阳性信号的微孔数。从而得到，两边同时取

对数可得，经换算得。根据最终检测结果，可以通过阴性反应的数量和稀释倍数实现对目标

DNA 的绝对定量。

　　 2　、d　PCR 在生物学检测中的应用

d PCR 发展至今已近 20 年，因其具有检测灵敏度高、特异性强且有效避免 PCR 抑制剂的影响

等优势，在分子检测和疾病诊断等领域都得到了广泛应用。根据Pub Med 数据库统计结果，截

至2020 年6月，与d PCR 相关的研究报道有3 679 篇，尤其是近几年随着d PCR 仪器的不断开

发，有大量的研究报道进一步证实了 d PCR 的优势。表 3总结了近年来利用d PCR 实现生物学

检测的研究。

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摘要：

dPCR的原理及在生物学检测中的运用　　摘　　　　　要：数字PCR(digitalPCR,dPCR)是在普通PCR和定量PCR基础上发展的第三代PCR技术，通过有限稀释和泊松分布统计实现精确的绝对定量检测。相比于前两代PCR技术，dPCR能够实现DNA模板的绝对定量且对PCR抑制剂具有更强的耐受性。目前，该技术在致病菌和病毒、基因突变、甲基化DNA、转基因成分和食品掺假的检测中都得到了广泛的应用。该文介绍了dPCR的原理并综述了其在生物学检测中应用的研究进展，以期为基于dPCR的检测方法的开发和应用提供参考和依据。　　　Abstract　：DigitalPCR(dPCR)isathird-ge...

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