DNA链式聚合反应中手性氨基酸的作用
DNA 链式聚合反应中手性氨基酸的作用
摘 要： 构成天然蛋白质的氨基酸为 L构型，D构型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本
结构单元，但许多植物、微生物甚至在人体中都有 D-氨基酸的存在。DNA 聚合酶链式反应广
泛发生在生物体内及 PCR 实验中，首次探究手性氨基酸及其与金属离子协同条件下对 Taq-
DNA 聚合酶催化下的 DNA 链式聚合反应的影响情况，为进一步研究手性氨基酸及金属离子对
生物体的影响提供实验依据。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，酸性氨基酸对于 DNA 链式
聚合反应有抑制作用，极性不带电荷氨基酸其 L构型对引物延伸的抑制作用大于 D构型氨基
酸，而极性带正电荷的氨基酸 D构型与 L构型的作用则与其相反。在加入 Na+、K+、Ca2+等9
种金属离子及手性氨基酸的实验当中，铝盐及锆盐溶液对 PCR 实验几乎完全抑制;镍、铜、钙
对其影响次之。加入手性氨基酸金属络合物之后，其影响结果部分发生改变。
关键词 : 手性氨基酸;金属离子; DNA 链式聚合; Taq-DNA 聚合酶，
Abstract： The amino acids that make up natural proteins are L-conformation. Although
Dconformation amino acids are not the basic structural units of proteins, many
plants,microorganisms,and even human bodies have D-amino acids. DNA polymerase chain reaction
occurs widely in organisms and in PCR. In this paper, the effect of chiral amino acids and their
coordination with metal ions on DNA chain reaction catalyzed by Taq-DNA polymerase was
investigated for the first time. It provides experimental basis for further study of the effects of chiral
amino acids and metal ions on organisms. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showed that
acidic amino acids had inhibitory effect on DNA chain polymerization,and the polar uncharged amino
acids. The inhibition of primer extension by L configuration was greater than that of D configuration
amino acids,whereas the D structure of polar positively charged amino acids was opposite to that of L
configuration. In the experiments of adding 9 metal ions such as Na+,K+,Ca2+,and chiral amino
acids,the PCR was almost inhibited by aluminium and zirconium salts,followed by nickel,copper and
calcium. When chiral amino acid metal complexes were added,the influence of chiral amino acid metal
complexes on the results was partly changed.
Keyword： chiral amino acids; metal ions; DNA chain polymerization; Taq-DNA polymerase;
手性是生物化学和医学等各个领域中热点问题之一[1,2]。DNA 作为生命体中重要的遗传
物质，通过转录合成 m RNA 进而控制氨基酸合成蛋白质[3]。而氨基酸作为构成蛋白质的基本
单位，广泛存在于生命体内。在 20 种组成人体蛋白质的氨基酸当中，构成蛋白质的天然氨基
酸为 L构型(L-AAs)，这确保了蛋白质的一级结构，使蛋白质达到预期的功能[4]。非天然的 D
型氨基酸(D-AAs)虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但在许多植物、微生物甚至是人体中
都有存在。这些 D-AAs 主要是 L-AAs 的非生物酶的外消旋产物或由其他 D-AAs 的氨基转移酶
合成的产物获得的[5,6]。DNA 聚合反应在 DNA 聚合酶的作用下进行，来自水生嗜热杆菌的
DNA 聚合酶 I[7](TaqDNA 聚合酶)在聚合酶链式反应(PCR)的生物技术中起着重要作用[8,9]。
D-氨基酸体外来源有服用一些药物和日常食物含有的 D-氨基酸，某些药物如由微生物制
得的某些抗生素就会有 D-缬氨酸、D-丝氨酸等[10]，也有些药物如利尿药、低血糖、低血钙药
物能抑制 D-氨基酸氧化酶的合成，使体内 D-氨基酸水平增加。
D 氨基酸对人体的影响一直有所争议，D-AAs 通常在羊水或脑脊液中含量最低(低于相应
的L-AAs 的1%)。而尿液中含量最高(通常为 10%以下)[11]。D-天冬氨酸(Asp)和D-丝氨酸(Ser)
残基在不同的衰老组织中均有特异性检测;例如，在视网膜、结膜、角膜[12,13]、牙齿、骨骼
[14]、动脉壁、韧带、大脑[15]、皮肤[16]中都发现了D-Asp 残基，而在大脑中也发现了D-Ser
残基[17,18]。人眼因 D氨基酸含量增多而失去光泽甚至病变;在老年痴呆的人的大脑中发现D
氨基酸的含量增加[19];据报道 D-谷氨酸浓度的增加会对酵母细胞的生长产生较强的抑制作用
[20]。但也有研究发现添加D-氨基酸混合物可提高乳酸链球菌的耐酸能力，提高乳酸链球菌内
酯的产率[21];在皮肤屏障功能受损时，促进细胞间脂质的生成，加快屏障功能恢复。在真皮纤
维母细胞(FB)中，D-天冬氨酸能够减轻因自由基产生源的增加而引起的氧化毒性。另外，D-蛋
氨酸亦显示出对于 FB 的紫外线损伤有抑制效果。D-氨基酸目前已被应用至护肤品当中[22]。
游离型 D-丝氨酸局部存在于成熟哺乳动物的前脑(大脑皮质、海马区等)，与神经传导的调节有
关[23,24,25]。
Taq-DNA 聚合酶由于其优异的热稳定性是 PCR 中常用酶之一。金属离子如
Ca2+、Ni2+、Cr3+已被报道影响 DNA 聚合酶的活性[26,27]。铁钴(II)单、双链小分子螯合物抑
制转录过程的发生[28]。环烯醚萜、马鞭草苷及其衍生物对 TaqDNA 聚合酶有抑制作用[29]。
还有一些抑制剂包括双脱氧核苷酸、磷脂、脂肪酸、类黄酮、三萜类、喜树碱、花青素和椭圆
苷类已被用于临床试验[30,31,32,33]。但目前手性氨基酸及其与金属离子配合物对 DNA 聚合反
应的影响仍未见报道。
本文是在 Taq-DNA 聚合酶作用下进行的 DNA 链式聚合反应，同时加入手性氨基酸、手性
氨基酸与金属离子共混液、金属离子等，改变 DNA 链式聚合反应体系的反应环境。通过变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳将产物进行分离，使用 Image Lab 软件进行条带含量分析，通过分析反应
条带百分比和统计学显着性水平验证确定手性氨基酸等因素对 DNA 链式聚合反应的影响。同
时进行手性氨基酸对 DNA 链式聚合反应影响的时间动力学分析、手性氨基酸与金属离子的共
同作用等实验，进一步验证手性氨基酸对 DNA 链式聚合反应的影响情况。
1 、实验部分
1.1 、材料与试剂
实验所用的药品是分析纯。所有溶液用超纯水配制。DL-丙氨酸(DL-Ala),DL-缬氨酸(DL-
Val)等手性氨基酸均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氯化钠(Na Cl)、氯化铝(Al Cl3)、
氯化钾(KCl)、氯化钙(Ca Cl2)等金属盐购于北京化工厂。d NTP、转录模板链和 5'-FAM 标记引
物订购于上海生工生物股份有限公司。Taq DNA 聚合酶及 10×Taq Buffer 购于北京天根生化科
技有限公司。
1.2 、主要仪器与设备
仪器使用 Thermo Nano DropTMOne 超微量紫外分光光度计、Bio-Rad Chemi Doc XRS 高灵
敏化学发光成像系统、Bio-Rad 凝胶电泳仪及PCR 仪。
1.3 、手性氨基酸浓度的确定
手性氨基酸溶液均由超纯水配制成 50 mmol/L 水溶液，使用 Thermo Nano Drop 超微量紫外
分光光度计全波长(200～900 nm)扫描确定手性氨基酸的紫外吸收峰强度。由测量结果(表1)可
知，同种手性氨基酸的吸收强度基本一致，即DL 两种构型氨基酸浓度相同，符合实验条
件。20 种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在近紫外区只有3种氨基酸有光吸收能力，这 3种
氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)，因为它们的R基含有苯环共轭双键系
统。
表1 手性氨基酸(50 mmol/L)超微量全波长扫描表
1.4 、 手性氨基酸影响下的 DNA 引物延伸
手性氨基酸作用下的 DNA 链式聚合反应结果是通过检测产生的引物延伸的量来测定的。
其反应体系包括 T-25 (5'-GACACGCTCTATAGTGAGTCGTATT-3')模板及P-17(5'-
AATACGACTCACTATAG-3')荧光标记引物，通过羧基荧光素标记的引物在 488 nm 波长激发
下会发出荧光信号，当模板与引物发生链式聚合反应，即T-25 与P-17 发生结合并进行引物延
伸，25 bp 处会出现相应的荧光信号。通过检测分析25 bp 处荧光信号强弱来确定DNA 链式聚
合的反应情况。取模板与引物各 1μL(10μmol/L)溶解于2μL 10×Taq Buffer 中，95℃下高温退火
5 min，降至室温后，进行平行实验。手性氨基酸及各个金属盐溶液(Na Cl、Al Cl3、KCl、Ca
Cl2、Fe Cl2、Fe Cl3、Ni Cl2、Cu Cl2、Zr Cl4)均配置成50 mmol/L 溶液，并按体积比 2 1∶混
合均匀，室温下放置 24 h，待手性氨基酸与金属离子充分作用后进行实验。反应体系中加入
1μL(10 mmol/L)的d NTP，用 dd H2O 补齐至20μL 反应体系。最后同时加入 0.5 U 的Taq DNA
聚合酶在 55℃恒温孵育 30 min。反应完成后加入同等体积的指示剂缓冲溶液(90%去离子甲酰
胺，25 mmol/L EDTA,0.02%溴酚蓝)混合均匀后放入-20℃冰箱内冷藏，使所有实验组反应停止
时间一致。取4μL 样品注射到含有 7 mol/L 尿素的 20%变性聚丙烯酰胺凝胶中，150 V 电泳 1
h，电泳缓冲液为 1×TBE 缓冲液。经Bio-Rad 的Chemi Doc XRS 化学发光凝胶系统成像，通过
Image Lab 软件进行条带分析。其反应条带百分比(Bypass)为模板与引物反应生成产物的量与该
泳道剩余引物及产物之和的比值。
1.5 、DNA 引物延伸时间动力学测定
与手性氨基酸影响下的 DNA 引物延伸实验类似，加入 Taq DNA 聚合酶在 55℃恒温孵育
后，分别在0、5、10、15、20、25、30 min 时间点进行取样。将样品加入同等体积的缓冲液混
合均匀后放入-20℃冰箱内，确保停止反应。取4μL 反应溶液加入至 20%变性聚丙烯酰胺凝胶
泳道中，进行 150 V 电泳 1 h。通过化学发光凝胶成像仪进行成像，使用 Image Lab 软件进行条
带分析。
2 、结果与讨论
2.1 、非极性手性氨基酸对 DNA 链式聚合反应的影响
非极性氨基酸共有9种，其中非极性脂肪族 R基氨基酸有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨
酸(Val)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile);非极性芳香族 R基氨基酸有苯丙氨酸
(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)。除甘氨酸无手性对映体外，其余氨基酸均有 D、L两种手性
构型。选取丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸进行实验，选取重复实
验3次结果作图，并计算氨基酸与空白组及手性氨基酸 D、L构型之间的显着性水平(P-
Value)。其中 10 mmol/L 非极性手性氨基酸对 DNA 链式聚合反应 30 min 条件下的影响结果见
图1。
图1 非极性手性氨基酸对 DNA 链式聚合反应产物影响
摘要：
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DNA链式聚合反应中手性氨基酸的作用 摘 要： 构成天然蛋白质的氨基酸为L构型，D构型氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但许多植物、微生物甚至在人体中都有D-氨基酸的存在。DNA聚合酶链式反应广泛发生在生物体内及PCR实验中，首次探究手性氨基酸及其与金属离子协同条件下对Taq-DNA聚合酶催化下的DNA链式聚合反应的影响情况，为进一步研究手性氨基酸及金属离子对生物体的影响提供实验依据。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，酸性氨基酸对于DNA链式聚合反应有抑制作用，极性不带电荷氨基酸其L构型对引物延伸的抑制作用大于D构型氨基酸，而极性带正电荷的氨基酸D构型与L构型的作用则与其相反。在加...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
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时间：2024-04-20
