蛋白质的提取与分析方法探析

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蛋白质的提取与分析方法探析

　摘　　　　要：　随着人们对基因结构的了解加深，关于生命科学的研究也慢慢进入了后基因组时

代，这也就是功能基因组时代。功能基因组顾名思义就是对基因的功能进行挖掘，中心法则中

DNA 会调控 RNA 的转录，RNA 又会调控蛋白质的翻译，但实验结果表明 RNA 对蛋白质的翻

译率并不是很高，而蛋白质又是生命活动最直接的执行体，因此对蛋白组学的研究将成为生物

学研究的一个热点，将会为生命活动原理的解读带来重大的贡献。本文就通过对蛋白组学的相

关论文进行总结，分析蛋白组学目前使用的研究方法，并对相关蛋白质的分离进行重点介绍。

　　　　　　 Abstract 　：With　the　deepening　of　people's　understanding　of　gene　structure,　research　on　

life　sciences　has　gradually　entered　the　postgenomic　era,　which　is　also　the　era　of　functional　genomics.　

The　functional　genome,　as　its　name　implies,　is　to　excavate　the　function　of　genes.In　the　central　law,　

DNA　regulates　the　transcription　of　RNA,　and　RNA　regulates　the　translation　of　proteins.　However,　

experimental　results　show　that　the　translation　rate　of　RNA　to　proteins　is　not　very　high,　and　proteins　are

the　most　direct　executive　body　of　life　activities,　so　research　on　proteomics　will　become　a　hot　spot　in　

biological　research,　and　it　will　bring　significant　contributions　to　the　interpretation　of　the　principle　of　

life　activity.　This　article　summarizes　the　relevant　papers　on　proteomics,　analyzes　the　research　methods　

currently　used　in　proteomics,　and　focuses　on　the　separation　of　related　proteins.

　　　 Keyword：　 proteomics;　research　methods;　protein　separation;

　 0 　、引言

蛋白质组是指一种细胞、组织乃至一种生物所表达的全部蛋白质。相较于传统的蛋白质研究，

蛋白质组学可以在大规模水平上一次性鉴定成千上万种蛋白质的表达水平、修饰水平相互作用

等，从而揭示蛋白质参与生命活动的作用。近几年来蛋白组学不断发展，蛋白组学在各个方面

应用越来越广泛，如植物逆境蛋白组学在研究植物的生长、发育、代谢等生理活动规律；另

外，蛋白组学也渐渐成为肿瘤研究中寻找标志物的有力手段，为肿瘤的致病机理研究及药物研

究提供了新思路。蛋白组学也渐渐成为生命科学研究的最前沿领域。

　 1 　、蛋白质的提取

为了更好地研究蛋白质，首先要做的就是从组织样本中获取较纯的蛋白样品。蛋白存在于组织

细胞中，获得蛋白之前需要将组织细胞进行破碎，破碎细胞的方法包括石英砂研磨、超声波震

碎、微波提取法、超临界萃取法、反复冻融法、高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、振荡珠击破

碎法、高速搅拌珠研磨破碎法、渗透压冲击破碎法、酶溶破碎法、化学破碎法、去垢剂破碎法

等。将蛋白从组织细胞中释放出来后就可以进行蛋白质组学研究的后续过程，包括蛋白纯化、

鉴定等过程。

1.1 　、蛋白质的沉淀

在将蛋白质从组织细胞中释放出来的同时还会在蛋白的提取液中混有其他的物质，为了更好的

研究蛋白质，需要将蛋白质从复杂体系中纯化出来，首先考虑根据蛋白质的特性将其从复杂体

系中沉淀下来，常用的蛋白质沉淀方法有盐析法和有机溶剂沉淀法。

　 1.2 　、蛋白质的分离

蛋白质的分离在最开始是用一些简单的离心技术进行处理的，但仅利用物理方法无法实现物质

彻底的分离，分离后仍混有较多杂质，而蛋白质组质谱技术要求较精确，目前蛋白质组的分离

方法朝向更加精确的方向发展，例如双向电泳法，高效液相色谱法等。

　 1.2.1 　、离心法

离心法是较为基础的分离方法，高速旋转中的物体会有强大的向心力，从而使得放入其中的物

体中的悬浮颗粒发生不同程度的漂浮或沉降，最终使得部分颗粒发生浓缩，与其他物质发生分

离，整体的操作没有太高的技术要求但无法将各物质彻底分离，如 Herbik 等在 1996 比对正常

番茄与缺铁性番茄中蛋白质表达方式的不同时，使用离心法无法完全分离甘油醛＿3＿磷酸脱

氢酶，甲酸脱氢酶等一些可帮助获得铁的酶，使用更精确的双电泳凝胶法才将此类酶成功分

离。一般，离心法无法将物质完全分离，处理后产物仍混有较多杂质，需要在离心后采用其他

技术进行下一步分离。

　 1.2.2 　、色谱法

离子交换色谱法。离子交换色谱法是利用蛋白质含电量的不同进行分离，层析柱中填充阴

（阳）离子交换树脂颗粒，根据电荷同性相斥，异性相吸的原理，洗柱时用含阴（阳）离子的

溶液，若蛋白质所带电荷较小，静电力较小，则会先与层析柱分离，增加溶液离子浓度，所带

电荷较多的蛋白质也会与层析柱分离，即可分离蛋白。

凝胶排阻色谱法，或称凝胶过滤或分子筛，当分子量不同的物质通过多孔性亲水性凝胶时，若

蛋白质分子直径太大无法进入凝胶的孔径内，则不会通过凝胶内部直接顺着凝胶的缝隙流出，

若蛋白质分子直径小于凝胶的孔径，则会进入凝胶内部，增大了通过凝胶需经过的长度。这

样，通过在柱内停留时间的不同，可达到将蛋白质分离的目的。（如图2)

图1　离子交换层析原理（赵永，2015)

图2　凝胶排阻色谱法原理（王娜娜、姚秀清等，2011)

如阮振刚等在检测酚醛树脂中的游离酚时，使用凝胶排阻色谱法无法得到分离度很好的谱峰，

增大了实验的误差。

亲和色谱法利用某些物质存在特异性结合，混合物通过层析柱时柱内凝胶只与和凝胶有特异性

结合的物质结合达到从原混合物中分离特定物质的目的，抗体与抗原之间可用亲和层析进行分

离。

高效液相色谱法，采用高压输液系统，将待检测的液相进行多次的层析分析，随着蛋白质分离

检测的次数增多，蛋白质被检测的精度也越高。如高旭东等建立了黄芩苷，盐酸小檗碱和大黄

素的高效液相色谱检测方法；色谱法作为目前较为常用的方法，分离效率较高，具有较快的分

析速度，灵敏度高，选择性好，可同时分析多组，易于自动化，如张元梅等利用高效液相色谱

法鉴定柑橘过时中 18 种类黄酮的含量，实验结论证明其分离效果较好。经检测，各类黄酮均

被成功分离，偏差较小；但高效液相色谱法不能进行蛋白质的定性分析，不能进行相关蛋白质

的具体检测。

　 1.2.3 　、电泳法

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）。SDS—PAGE 法是利用蛋白质分子量大小不同进

行分离[8]。SDS—PAGE 技术相对误差较小，如朱广廉等在用 SDS—PAGE 分离蛋白质时测定

丙酮酸激酶等蛋白质的分子量,多次测定的误差均远小于利用层析法测定所产生的误差；但凝胶

浓度对实验的精确性有较大影响，在同一实验中，朱广廉等通过实验结果分析出若胶浓度太

低，无法分离核糖核酸酶和嗅酚蓝带，增大了实验的误差。若分离胶过浓，则无法分离分子量

相似的蛋白质分子，使实验误差增大。

1.2.4 　、等电聚焦法

等电聚焦法是利用蛋白质等电点不同进行分离。等电聚焦 pH 梯度电泳法可以随意设定p　H 梯

度，尤其第二轮分析可缩小测定pH 值的范围，提高分辨率及重复性。

　　　 1.2.5 　、双向电泳

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摘要：

蛋白质的提取与分析方法探析　摘　　　　要：　随着人们对基因结构的了解加深，关于生命科学的研究也慢慢进入了后基因组时代，这也就是功能基因组时代。功能基因组顾名思义就是对基因的功能进行挖掘，中心法则中DNA会调控RNA的转录，RNA又会调控蛋白质的翻译，但实验结果表明RNA对蛋白质的翻译率并不是很高，而蛋白质又是生命活动最直接的执行体，因此对蛋白组学的研究将成为生物学研究的一个热点，将会为生命活动原理的解读带来重大的贡献。本文就通过对蛋白组学的相关论文进行总结，分析蛋白组学目前使用的研究方法，并对相关蛋白质的分离进行重点介绍。　　　　　　Abstract　：With　the　deepening　o...

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