蛋白质羰基化途径及其富集化检测方法
蛋白质羰基化途径及其富集化检测方法
摘 要： 蛋白质羰基化作为一种不可逆的翻译后修饰,与诸多疾病和衰老密切相关。有
关蛋白质羰基化的各项研究受制于其低丰度、低电离效率及化学相对不稳定性而发展较慢。基
于质谱的蛋白质组学分析技术的进步,使蛋白质羰基化的规模化研究成为可能,进而为蛋白质羰
基化的相关调控通路研究提供了数据支撑。该综述介绍了蛋白质羰基化的概念、途径、检测方
式,并重点介绍了蛋白组学技术应用于蛋白质羰基化分析的进展。
Abstract： Protein carbonylation,an irreversible post-translational modification,is closely
related to many diseases and aging.The analysis of protein carbonylation is a challenge due to its low
abundance,low ionization efficiency and relative chemical instability.Advances in mass spectrometry-
based proteomics have made it possible to conduct large-scale studies on protein
carbonylation,providing in turn the data support for the study of related regulatory pathways of protein
carbonylation.The concept,pathways and analysis methods of protein carbonylation are presented in
this review,and the advances in proteomic analysis of protein carbonylation are highlighted.
Keyword： oxidative stress; protein carbonylation; proteomics;
1 、 氧化应激与蛋白质羰基化
绝大多数真核生物的生命活动都离不开氧气,氧气与高等生物体的能量代谢等过程密切相关
[1,2]。氧气分子在代谢中间体、酶和辐射作用下产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),其在
正常生理条件下对细胞代谢的调控发挥着至关重要的作用[3]。然而,当产生的 ROS 超过生命体
内源性抗氧化防御的缓冲能力,即氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡被打破时,将导致氧化还原信
号与控制机制的破坏和/或分子损伤[4],产生氧化应激效应(Oxidative stress,OS),进而导致脂
质、DNA/RNA 和蛋白质等重要生命体活动承担者的功能受损。当持续氧化应激产生时,将对蛋
白质、DNA 和RNA 等生物分子造成不可逆损伤,并造成蛋白酶体和溶酶体降解氧化损伤蛋白质
的能力降低,使细胞活力降低,甚至造成细胞死亡[5,6]。氧化应激异常与衰老过程以及多种疾病
的发生密切相关,包括动脉粥样硬化、恶性肿瘤、阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病
[7]。
蛋白质羰基化(Protein carbonylation,PCO)是指蛋白质在氧化应激状态下产生醛、酮或内酰胺等
活性羰基官能团[8]。PCO 是危害性最大的蛋白质翻译后修饰之一,可造成蛋白质结构的不稳定
和功能的不可逆损伤[9]。有关蛋白质羰基化的研究始于 20 世纪 80 年代初,由美国国立卫生研究
院(National Institutes of Health,NIH)的Stadtman 实验室开创[10]。蛋白质羰基化被视为氧化应激
的生物标志物,在细胞、组织和器官衰老中的作用受到特别关注[11]。Levine 和Stadtman 提出蛋
白质羰基化水平随着年龄的增长而增加,以此支持细胞或生物体水平上衰老的自由基(氧化应激)
理论[12,13,14,15],故蛋白质羰基化是与衰老相关的重要候选生物标志物。同时,蛋白质羰基化会
调控蛋白功能,进而影响相关信号转导网络,造成疾病相关蛋白质功能的不可逆损伤[16]。因此,
羰基化对于蛋白质功能的发挥具有至关重要的调节作用,实现蛋白质羰基化的表征,可以提供氧
化应激相关蛋白的作用网络,为相关疾病的分子机制研究提供重要信息[17]。
2 、蛋白质羰基化途径
蛋白质羰基化存在超过 35 种形式[18],按照其产生方式主要分为以下 4类[10](图1)。
图1 蛋白质羰基化的主要途径
Fig.1 Main protein carbonylation pathways
2.1 、 蛋白质、多肽主链骨架的裂解
蛋白质的多肽骨架中氨基酸的α-碳原子可被 ROS 攻击,形成烷氧基自由基,随后以 α-酰胺化或二
酰胺途径裂解。前者的键断裂发生在自由基起始位点的 N-末端一侧,使来自蛋白质 N-末端部分
的多肽片段带有C-末端酰胺,而来自蛋白质 C-末端部分的多肽N-末端具有N-α-酮酰基;后者的
骨架裂解由 α-碳起始位点的 C-末端侧的键断裂引起,使来自蛋白质 N-末端部分的新多肽的C-末
端形成二酰胺,而来自蛋白质的 C-末端部分的多肽N-末端产生异氰酸酯基团。
2.2 、 蛋白质氨基酸侧链的氧化
ROS 可通过直接攻击苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的侧链,引入活性羰基。以赖氨酸为例,
羟基自由基在赖氨酸侧链的C6 位置夺取氢,形成以碳为中心的自由基。过渡金属离子接受碳自
由基的孤电子对后,产生赖氨酸亚胺,随后通过释放铵离子自发水解成氨基己二酸半醛(AAS)。类
似地,精氨酸氧化成谷氨酸半醛(GGS),苏氨酸氧化成 2-氨基-3-酮丁酸,脯氨酸氧化得到GGS 和2-
吡咯烷酮。
2.3 、 脂质过氧化产物对蛋白活性位点的加成
ROS 对脂质的进攻引起脂质过氧化(Lipid peroxidation),产生 α,β-不饱和醛、二醛和酮醛等被称
为活性羰基物质(Reactive carbonyl spices,RCS)的代谢产物(又称 Lipid-derived electrophiles,LDEs,
即脂质衍生亲电试剂),如丙烯醛(Acrolein,ACR)、丙二醛(MDA)、4-羟基-2-壬烯醛(4-Hydroxy-2-
nonenal,HNE)等。这些活性羰基物质可以通过迈克尔加成或生成席夫碱的形式加合到亲核氨基
酸(即半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸)上引入活性羰基。研究这类共价修饰作用不仅能够发现亲电
性化学信号的调控机制,而且对目前药物化学领域热门的靶向共价抑制剂开发有着重要参考价
值。
2.4 、 糖化的氧化产物
氨基酸和还原糖之间发生被称为美拉德反应的非酶促反应,在一系列化学重排之后,可以在蛋白
质侧链引入活性羰基。除此之外,糖酵解中间体降解产生的小分子醛类,如乙二醛(MG)、甲基乙
二醛(MGO)和3-脱氧葡糖醛酮(3-DG)也可以加合在蛋白质上从而引入活性羰基。
3 、 蛋白质羰基化的富集检测方法
目前,蛋白质羰基化的鉴定和定量技术主要分为以下 3类:(1)分光光度法和色谱法测定总蛋白质
羰基含量;(2)生物化学和免疫学技术,如免疫印迹和ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay ,
酶联免疫吸附测定法),提供有关修饰蛋白和羰基化水平的全局性信息;(3)基于质谱(MS)的羰基化
检测技术,用于鉴定蛋白质的修饰位点以及蛋白质结合的羰基化合物的相对定量[19]。质谱以外
的其他方法虽然能够高灵敏度检测氧化修饰蛋白质,却不能提供修饰蛋白质特性以及修饰本身的
化学性质和位点等信息。基于质谱的蛋白质组学的进步,使蛋白质羰基化的规模化研究成为可
能,进而为蛋白质羰基化的相关调控通路研究提供了数据支撑[19]。目前采用的蛋白质组学方法
主要分为凝胶电泳与非凝胶电泳两大体系(图2)。
图2 蛋白质羰基化蛋白组学分析方法
Fig.2 Proteomics analysis methods of carbonylated protein
3.1 、 凝胶电泳体系
二维(2D)凝胶电泳已被广泛用于复杂样品中羰基化蛋白质的鉴定。由于相对丰度低、化学稳定
性差、缺乏特定的物理化学性质(如吸收或荧光),羰基化蛋白质通常无法直接检测,其检测和定量
需要使用特定的化学探针进行衍生化[15]。
2,4-二硝基苯肼(2,4-Dintrophenylhydrazide,DNPH)可与活性羰基反应,形成稳定的 2,4-二硝基苯
腙,其吸收光谱在 365～375 nm 处具有特征吸收峰。Levine 等[20]首先使用 DNPH,通过 DNP(2,4-
二硝基苯基)基团在 360 nm “处的吸光度来测定羰基化程度。这一思路被发展为 oxyblot”技术应
用于蛋白质印迹法,即先用DNP 衍生羰基化样品,再使用抗 DNP 抗体进行检测[21,22],还可以通
过质谱法进行凝胶内消化后对羰基化修饰位点进行鉴定。
酰肼基团可以与活性羰基反应形成腙加合物,其含有的不稳定亚胺键,可被氰基硼氢化物特异性
还原。此外,酰肼还可以引入多种官能团(如生物素、洋地黄毒苷和与酰肼偶联的各种荧光化合
物等)后再与羰基反应,如可以用洋地黄毒苷-酰肼衍生化羰基并以抗洋地黄毒苷抗体进行检测,或
用生物素-酰肼衍生化并用荧光素标记的亲和素检测。荧光素缩氨基硫脲和荧光素酰肼首先由
Stadtman 等[23]用于在一维凝胶中检测羰基;Regnier 等[24]采用生物素化和亲和素-异硫氰酸荧
光素(Biotinylation and avidin-fluorescein isothiocyanate,FITC)亲和染色法,建立了二维电泳中羰基
化蛋白的检测方法,在用过氧化氢刺激后的酵母蛋白质组中鉴定出 20 种羰基化蛋白质。2D 凝胶
电泳可以在各种生物条件下用于差分氧化蛋白质的鉴定,但其灵敏度较低,不易检测低丰度的蛋
白质,操作费力且不允许高通量检测[25]。
3.2 、 非凝胶电泳体系
质谱法是蛋白质组学中用于鉴定蛋白质,尤其是 PTM(Post-translational modification,翻译后修饰)
表征的最通用技术。使用质谱法的无凝胶方法已经成为研究蛋白质羰基化的最有力技术。蛋白
质羰基化的各项研究受制于其低丰度、低电离效率、可能产物的异质性以及与分析期间存在的
其他化合物的反应性。因此在质谱分析之前,分离羰基化肽和蛋白质的富集策略通常是必需的
[26]。
摘要：
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蛋白质羰基化途径及其富集化检测方法 摘 要：蛋白质羰基化作为一种不可逆的翻译后修饰,与诸多疾病和衰老密切相关。有关蛋白质羰基化的各项研究受制于其低丰度、低电离效率及化学相对不稳定性而发展较慢。基于质谱的蛋白质组学分析技术的进步,使蛋白质羰基化的规模化研究成为可能,进而为蛋白质羰基化的相关调控通路研究提供了数据支撑。该综述介绍了蛋白质羰基化的概念、途径、检测方式,并重点介绍了蛋白组学技术应用于蛋白质羰基化分析的进展。 Abstract：Proteincarbonylation,anirreversiblepost-translationalmodification,iscloselyr...
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作者：闻远设计
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时间：2024-04-20
