多重链接探针扩增技术的反应步骤与应用

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多重链接探针扩增技术的反应步骤与应用

多重链接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）最早是由荷兰

的Schouten 博士于 2002 年发明的，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行检测和分析的

新技术[1].该技术仅需 20 ng/μL 模板 DNA 或RNA,即可通过简单的探针杂交、连接及 PCR 扩增

和电泳步骤，在同一反应管中对多达 50 个不同的靶基因进行检测和分析。该技术经过短短几

年的发展，目前已经在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用[2-3].

1MLPA 的原理

MLPA 技术是将核酸的杂交检测和 PCR 链式扩增相结合，从而实现多对靶分子的高效特异性分

析。其核心技术是设计与目的靶序列高度特异性的长探针和短探针，发生 MLPA 反应时，这两

段探针首先分别与模板序列杂交，之后通过连接酶将两段探针进行连接。连接反应高度特异，

只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段

探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱

基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。长探针和短探针发生连接后，生成一

条两端分别含有上下游通用 PCR 引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式

放大，最后生成的 PCR 扩增产物通过毛细管电泳分离，再经软件分析[1].

2MLPA 反应步骤

2.1 探针与靶序列杂交

在MLPA 反应中，一个目标序列需要设计一对探针，包括长探针和短探针，短探针由两段核苷

酸组成，包括位于 5‘端的 PCR 通用正向引物序列和位于 3’端的模板特异性序列；长探针由三

段核苷酸组成，包括位于 5‘端的模板特异性序列和 3’端的通用反向引物序列外，在两者之间还

添加了大小不等的填充序列（指纹序列），填充序列不是必须的，主要是用于区分扩增产物的

大小。MLPA 反应时，首先将双链 DNA 在98℃变性裂解，裂解为单链 DNA,温度降为 60℃时

长短探针分别与单链 DNA 过夜杂交[1-3].

2.2 探针的特异性连接

调节温度降为 54℃，加入连接酶。如果被检核酸中含有靶序列，则长短探针可均与模板序列互

补良好，连接反应可以进行，长短探针可以连接为一条完整的核酸单链。若其中一条探针的序

列与被检靶基因序列不完全互补，即使只有一个碱基不互补，也会使杂交不完全而使连接反应

无法进行。这种连接是高度特异性的，保障了 MLPA 的高特异性优势[1-4].

2.3PCR 扩增

MLPA 扩增的并不是被检样本核酸，而是上述连接生成的与靶序列结合的完整核酸探针，只要

有一条完整的核酸单链生成了，PCR 扩增反应即可进行，这保证了 MLPA 技术的高灵敏性。连

接反应完成后，每一条完整的核酸单链 5‘端都带有通用 PCR 正向引物，3’端都带有通用 PCR

反向引物。由于事先给每种被检基因的长探针加入了特定大小的指纹序列，每对探针的扩增产

物的长度都是唯一的，在通用引物的扩增下，这些大小不同的扩增片段被同时扩增了出来，一

般相邻两产物的长度差可以在 10 bp 之间，这样可以同时检测的基因数可高达 50 种不同靶基因

[1-4].

2.4 毛细管电泳分析

PCR 扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳分离分析，也可通过毛细管电泳等进行分离分析。但一般情

况下由于多重扩增的不同片段之间相差较小，而且，扩增片段大小多集中于 90~150 之间效果

较好，普通琼脂糖凝胶电泳无法分离，建议使用毛细管电泳，再用相关软件分析电泳结果[2,4].

3MLPA 的优缺点

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摘要：

多重链接探针扩增技术的反应步骤与应用多重链接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）最早是由荷兰的Schouten博士于2002年发明的，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行检测和分析的新技术[1].该技术仅需20ng/μL模板DNA或RNA,即可通过简单的探针杂交、连接及PCR扩增和电泳步骤，在同一反应管中对多达50个不同的靶基因进行检测和分析。该技术经过短短几年的发展，目前已经在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用[2-3].1MLPA的原理MLPA技术是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而...

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