分析传感中M13噬菌体的运用综述

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分析传感中 M13 噬菌体的运用综述

　　摘　　　　要：　为生物传感分析选择合适的目标识别分子是提高检测灵敏度和准确度的关键。

为此，人们开发了一系列诸如小分子、抗体、多肽和适配体等亲和配体。基于噬菌体展示技术

筛选出数千种特异性配体，可以噬菌体为组合元件构建生物传感探针。该方法具有优异的靶向

能力，并具有较强的环境耐受性。常见的 M13 噬菌体表面由多达 2　700 个拷贝的主要衣壳蛋白

pVIII 通过螺旋形式包裹内部的单链环状 DNA 而成，两端分别还有 3～5个拷贝的次要衣壳蛋

白pVII、pIX 和pIII、pVI。通过噬菌体展示技术和化学修饰可对噬菌体进行功能化改造，M13

噬菌体目前已成功应用于生物、化学、医学、材料和能源等领域。该文探讨了 M13 噬菌体在

传感分析领域的应用，并展望了基于 M13 噬菌体传感探针的发展趋势。

　　　　 Abstract 　：The　key　factor　to　improve　the　sensitivity　and　accuracy　of　biosensing　is　to　

select　suitable　target　recognition　molecules.Currently,　antibodies,　aptamers,　peptides　and　antibiotics　

are　regarded　as　the　most　frequently　used　target　recognition　molecules.However,　the　molecules　

mentioned　above　have　a　certain　limitations.For　instance,　antibodies　and　aptamers　suffer　from　high　

production　cost　and　difficulties　for　long-term　storage,　whereas　peptides,　antibiotics　have　a　relatively　

low　specificity　towards　the　analyte.Therefore,　it　is　necessary　to　find　more　superior　substitutes.M13　

phage　is　a　type　of　flexible　filamentous　bacteriophage　which　could　specifically　infect　E.coli　with　F　

factor.Due　to　its　simple　component　and　clear　genetic　background,　M13　phage　becomes　one　of　the　

bacteriophages　with　earliest　research　history.M13　phage　is　the　bacteriophage　used　by　the　2018-Nobel　

Prize　winner-George　Smith　to　develop　the　phage　display　technology.By　using　phage　display　

technology,　the　foreign　peptide,　protein　or　antibodies　could　be　fused　and　coexpressed　on　the　capsid　

protein　surface　of　M13　phage,　while　by　constructing　phage　display　peptide　library　with　phages　that　

display　various　types　of　peptide　and　using　biopanning　technique,　peptides　with　high　specificity　

towards　target　analyte　could　be　obtained.Up　till　now,　thousands　of　highly　specific　peptides　have　been　

selected　by　biopanning　from　various　phage　display　peptide　libraries,　and　their　affinities　towards　the　

target　analytes　are　comparable　to　those　of　antibodies.Under　this　circumstance,　M13　phage　with　

targeting　peptide　has　attracted　the　researchers'　interest　in　the　field　of　analytical　chemistry,　and　has　

become　a　novel　platform　for　the　construction　of　biosensing　analysis.M13　phage　consists　of　up　to　2　700

copies　of　primary　capsid　protein　pVIII　wrapped　in　a　helical　form　around　the　inner　ssDNA　and　3-5　

copies　of　minor　capsid　proteins　pVII,pIX,and　pIII,pVI　at　both　ends.This　structure　not　only　endows　it　

good　chemical　stability,　but　also　enables　it　to　be　functionalized　by　phage　display　technology　or　

chemical　modification.By　coupling　with　appropriate　signal　output,　M13　phages　could　be　used　for　

biosensing.In　fact,　M13　phages　are　an　ideal　platform　to　conduct　signal　simplification:　by　

displaying/modifying　the　3-5　copies　of　minor　capsid　proteins　pIII　with　target　recognition　peptide　and　

modifying　the　2　700　copies　of　primary　capsid　protein　pVIII　with　signal　probes,　one　target-binding　

event　can　trigger　a(3-5):2　700-fold　signal　amplification　in　theory.M13　phages　with　target　recognition　

peptide　on　their　pIII　protein　could　be　obtained　by　biopanning　from　phage　display　peptide　library　or　by　

phage　display　techniques,　whereas　the　signal　probes　reported　so　far　include　AuNPs,　AgNPs,　

fluorescent　dyes,　SERS　probes,　etc.The　detection　methods　coupled　with　M13　phages-based　sensing　

platform　include　colorimetric　method,　fluorescent　method,　SPR　detection,　electrochemical　sensing　and

quartz　crystal　microbalance　method,　etc.M13　phages　could　be　applied　not　only　for　the　sensing　for　

microbes,　metal　ions,　biomarkers　and　cells,　but　also　used　for　the　bioimaging　of　tumor　cells　and　

bacteria.Although　great　achievements　have　been　obtained　based　on　M13　phages,　the　M13　phages　

based　biosensing　still　has　some　limitations,　for　example,　due　to　the　technique　limitation,　large　proteins　

still　cannot　be　displayed　on　the　M13　phages　surfaces,　the　mechanism　for　the　interaction　between　target

analyte　and　M13　phages　needs　further　exploration.Nevertheless,　the　application　prospect　of　M13　

phages　in　the　field　of　analytical　chemistry　is　still　promising.In　this　review,　the　structures　of　M13　

phages,　phage　display　technology　and　their　application　in　the　fields　of　optical　sensing,　electrochemical

sensing,　quartz　crystal　microbalance　sensing　and　imaging　analysis　have　been　summarized.The　

development　trend　for　the　application　of　M13　phages　in　analysis　is　also　prospected.

　　 Keyword：　 M13　phage;　phage　display;　analysis;　biosensing;

　　生物传感分析在环境监测、食品安全、临床诊断以及生物反恐等领域发挥着重要作用，其

中，作为生物传感探针的核心元件，目标识别分子的选择至关重要，直接决定了检测的灵敏度

和准确度。为此，人们不断寻找各种与目标物具有亲和性和特异性的识别分子，如抗体、抗生

素、多肽及适配体等[1]。噬菌体展示技术是一种强大的分子进化手段，可在短时间内高效获取

亲和力媲美抗体的目标识别多肽[2]。将表面展示有目标识别多肽的噬菌体作为目标识别元件构

建传感分析体系，具有抗体、多肽和适配体不可比拟的优势[3,4,5,6,7]。M13 噬菌体是噬菌体展

示技术中应用最广泛和最成熟的噬菌体[8]。M13 噬菌体展示技术的初期研究主要集中在抗原表

位鉴定、抗体识别以及蛋白-蛋白间的相互作用等[9,10]。随着研究深入，M13 噬菌体精确的结

构特征、较强的环境适应能力以及低的生产成本等优势逐渐凸显，其应用也越加广泛。本文综

述了近年来 M13 噬菌体在光学传感、电化学传感、石英晶体微天平传感以及成像分析等领域

的应用，并对其在分析传感领域的应用进行了展望。

　　 1 　、M13 噬菌体的结构特征

　　 M13 噬菌体是一种专门感染细菌的柔性丝状病毒，具有严格的宿主选择性，对人体无

害。M13 噬菌体的结构简单，整体呈圆柱形，长880　nm,　直径6.6　nm[11](图1),其表面由多达 2　

700 个拷贝的主要衣壳蛋白 pⅧ 通过螺旋形式包裹而成，内部为单链环状 DNA[12];野生型

M13 噬菌体 pⅧ 亚基的前 8个氨基酸中有 2个氨基和 3个羧基暴露在外，因此可以对其进行

化学修饰而不影响病毒粒子的完整性和感染性[13]。同时，M13 噬菌体 pⅧ 蛋白中间部分的

非极性氨基酸提高了噬菌体的化学稳定性，使得 M13 噬菌体具有耐极端酸度和离子强度的能

力。此外，在噬菌体的两端分别还有管鞘状的 4种次要衣壳蛋白 pⅦ、pⅨ、pⅢ 和

pⅥ[14]。M13 噬菌体的 5种衣壳蛋白均由其内部的单链环状 DNA 编码而成，因此，通过基因

工程手段可以将外源多肽或蛋白与衣壳蛋白融合表达，从而实现 M13 噬菌体的表面功能化[15],

噬菌体展示技术也应运而生。

　　 2　、噬菌体展示技术

　　 1985 年，Smith[16]发现将外源基因插入丝状噬菌体 f1 Ⅲ的基因中时，该外源基因编码的

多肽会以融合蛋白的形式表达在噬菌体衣壳蛋白 pⅢ 中，从而创建了噬菌体展示技术。简单来

讲，噬菌体展示技术是通过基因重组的方式，将外源蛋白或多肽的基因序列插入噬菌体衣壳蛋

白的基因序列中，进而在噬菌体衣壳蛋白的相应位置表达出对应的外源蛋白或多肽而不影响噬

菌体正常生理功能的技术。该技术巧妙地实现了蛋白质基因型与表型的统一。利用噬菌体展示

技术可构建噬菌体展示文库，包括噬菌体肽库、噬菌体蛋白库以及噬菌体抗体库等。结合生物

淘选[4],即可从噬菌体展示文库中获得对特定目标如糖类、毒素、蛋白、小分子或完整细胞等

具有高特异性亲和力的噬菌体单克隆[17]。基于此，该技术能在短时间内将与靶标结合的克隆

进行反复筛选和扩增，最终实现多肽或蛋白的定向进化。噬菌体展示技术因此被认为是一种强

大的分子选择进化技术[18]。目前，噬菌体展示技术已被应用于抗原表位分析[19]、蛋白相互

作用[20]、疫苗研制[21,22]、药物研发[23,24,25]以及靶向多肽的筛选[26]等领域，利用该技术

可进化出抵抗自身免疫性疾病以及治愈转移性癌症的抗体，对保障人类健康意义重大，噬菌体

展示技术也因此获得了2018 年的诺贝尔化学奖[27]。此后，该技术在生物传感[28]、生物医学

[29]以及功能材料制备[30]等领域中得到了进一步应用。随着该技术在生物领域中应用的日益

深入，噬菌体制剂对人体的安全性也将逐渐引起人们的关注。目前，噬菌体展示技术依然需要

更深层次的探索，例如，噬菌体展示技术多用于表达分子量较小的多肽或蛋白，而对于分子量

较大的蛋白还存在着无法表达或表达数量极少的困境，这或许可以通过将多种噬菌体共同参与

蛋白表达来加以改进；同时，目前噬菌体展示技术的应用多停留于功能性噬菌体的构建或筛选

而忽略了噬菌体和靶标作用机理的深入研究，若能明确两者之间的相互作用并适当地对所表达

的多肽进行修饰，或可进一步增强噬菌体对靶标的结合能力。

　　 3　、M13 噬菌体的分析传感应用

　　对于分析传感而言，能够快速识别目标物并能产生可读信号的探针是其核心元件。检测探

针的选取往往取决于其特异性、选择性、检测性能、存储条件、可操作性及环境稳定性等

[17]。M13 噬菌体是噬菌体展示技术应用最广泛和成熟的噬菌体，其本身具有良好的水溶性、

化学稳定性以及较强的环境耐受能力；而得益于噬菌体展示技术的发展，M13 噬菌体还可表达

与目标物有特异性结合能力的多肽或蛋白，因而在分析传感领域表现出明显的优势：与抗体和

适配体相比，M13 噬菌体性能更稳定，在恶劣环境下不易失活且生产成本低[31];与杂交瘤技术

相比，M13 噬菌体展示技术的可筛选范围更广，并且可通过基因和分子进化方法调控探针的特

异性和选择性，以增强探针的亲和力和稳定性；同时M13 噬菌体的存储方便，在 37　℃下可至

少保存 6个月[32]。因此M13 噬菌体是用于构建传感探针的良好选择。

　　 3.1 　、光学传感

　　 3.1.1 　、免疫荧光法

　　 M13 噬菌体用于传感分析的最常用方法是将信号分子偶联到筛选所得的噬菌体衣壳蛋白表

面，从而实现目标物的识别与检测。如从噬菌体随机十二肽库中筛选得到与葡萄球菌毒素 SEB

有亲和力的 M13 噬菌体，并将荧光染料 Cy5 标记在该 M13 噬菌体上，可实现 SEB 的免疫荧光

检测，这也证明了噬菌体展示肽用于构建生物传感探针的可行性[33]。用 Cy5 标记的M13 噬菌

体作为传感探针还可检测海水中的 2,4,6-三硝基甲苯(TNT),这也是首例在非生理环境下进行噬

菌体筛选并检测小分子的报道[34]。此外，M13 噬菌体 pⅢ 蛋白通常为 3～5个拷贝，而体侧的

pⅧ 蛋白高达 2　700 个拷贝，因此，通过利用3～5个拷贝的 pⅢ 蛋白表达目标识别多肽，并

在2　700 个拷贝的 pⅧ 蛋白外偶联报告分子，即可实现有效的信号放大。如 Goldman 等[35]在

M13 噬菌体的 pⅢ 蛋白上表达了蓖麻毒素的单域抗体(sdAb),然后采用DyLight　549 对M13 噬菌

体的 pⅧ 蛋白进行荧光标记，和单独使用sdAb 进行荧光免疫检测相比，前者的检测灵敏度提

高了 5～10 倍，检出限从 1　ng/mL 降低至 64　pg/mL。

　　 3.1.2 　、表面等离子体共振分析

　　 20 世纪 90 年代，人们发现了表面等离子体共振(Surface　plasmon　resonance,　SPR)现象[36],

将SPR 效应与高特异性和高亲和力的抗体相结合可直接用于分析检测，无需进行额外信号标记

或样品预处理[37]。利用这一特性，人们发展了多种基于 SPR 效应的免标记光学检测方法

[38]。近年来，大量实验证明噬菌体可以有效替代抗体与 SPR 技术相结合，且噬菌体的生产成

本低、耗时短。Karoonuthaisiri 等[39]从商品化的 Ph.D.-12 噬菌体随机展示多肽文库中筛选得到

与沙门氏菌有特异性结合能力的 M13 噬菌体 MSal020417,并将该噬菌体固定到CM5　SPR 芯片

上，从而构建了基于 M13 噬菌体的 SPR 检测沙门氏菌的方法。Kim 等[40]采用基因工程手段在

M13 噬菌体 pⅧ 蛋白上融合表达了链霉亲和素结合短肽 HPQ,并将噬菌体定向排列构建 SPR

传感器用于捕获和检测链霉亲和素，噬菌体的各向异性有效提高了 SPR 的灵敏度，灵敏度可低

至fmol(图2A)。

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摘要：

分析传感中M13噬菌体的运用综述　　摘　　　　要：　为生物传感分析选择合适的目标识别分子是提高检测灵敏度和准确度的关键。为此，人们开发了一系列诸如小分子、抗体、多肽和适配体等亲和配体。基于噬菌体展示技术筛选出数千种特异性配体，可以噬菌体为组合元件构建生物传感探针。该方法具有优异的靶向能力，并具有较强的环境耐受性。常见的M13噬菌体表面由多达2　700个拷贝的主要衣壳蛋白pVIII通过螺旋形式包裹内部的单链环状DNA而成，两端分别还有3～5个拷贝的次要衣壳蛋白pVII、pIX和pIII、pVI。通过噬菌体展示技术和化学修饰可对噬菌体进行功能化改造，M13噬菌体目前已成功应用于生物、化学、医学、材...

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