功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究

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功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究

脂肪酶( lipase，EC 3. 1. 1. 3) 主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单

酯或二酯的酶，广泛应用于水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成

及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前用途最广泛的酶催化剂之一。猪胰脂肪酶( porcine

pancreas lipase，PPL) 是一类重要的脂肪酶，在食品、化妆品、医药、洗涤剂和畜牧业等领域

中均有广泛应用。然而，PPL 的应用仍然存在一些不足，如一般具有实际应用价值的目标化合

物并不是它的天然底物; PPL 活力不高，在有机溶剂、高温、极端 pH 等非天然环境下极易失活

等，这些不利因素限制了 PPL 在工业上进一步的广泛应用。因此，对 PPL 进行分子改性以强

化其催化性能，为工业应用提供活性更高、稳定性更好、环境耐受性更强的新酶品种，具有重

要的实际应用价值。

化学修饰具有廉价、周期短、实验室可行、容易创造新型的酶学性质等优点，是对脂肪酶进行

分子改性的一种重要手段。虽然化学修饰 PPL 已经取得了一定的研究进展，但仍然局限于脂肪

酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇( PEG) 和多糖等常用修饰剂的研究，修饰酶的催化活性、稳定

性、耐有机溶剂性等性能往往不能同时得到有效的改善以满足反应的需要。

离子液体近年来在生物催化领域的应用越来越广泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化

还原酶等多种酶都在离子液体中显示出了很好的稳定性。在离子液体中酶催化的区域、对映体

选择性往往都有所增加，尤其作为高极性底物的酶催化反应介质，离子液体显示出了巨大的潜

力。笔者所在课题组将功能化离子液体作为酶固定化载体材料 SBA-15 的表面修饰剂，结果表

明修饰载体固定化的酶对温度、pH 等的稳定性得到了有效提升，而且相对活力较游离酶有了

较大提高。在固定化方法中，离子液体作为载体修饰剂。近几年，Bekhonche 等首次提出了离

子液体修饰酶的新型化学修饰方法，用含羟基的咪唑、吡咯等离子液体修饰甲酸脱氢酶，修饰

酶的活性和稳定性得到了显着提升。这些研究说明离子液体不仅可以作为反应介质用于酶催化

反应中，还可以分别用作固定化载体及酶分子自身的修饰剂，目前还没有其他用功能化离子液

体修饰脂肪酶的报道。本文以PPL 为例，希望发展一种酶分子改造的新方法。

1 材料与方法

1. 1 药品与试剂

PPL 购自 Sigma 公司并在 0 ～4 ℃ 下保存，酶的蛋白质含量为9. 3%，以三乙酸甘油酯为底物

时比酶活力为 362 U/g( 45 ℃、pH 7. 5) 。3 种离子液体氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑( 99%) 、氯化

1-羧甲基-3- 乙基咪唑 ( 99% ) 、氯化1- 羧甲基-3- 丁基咪唑( 99%) 购自上海成捷化学有限公

司。1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺( 98%) 、N-羟基琥珀酰亚胺( 98%) 、吗啉乙磺酸

( 97%) 购自阿拉丁试剂公司。其余试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1. 2 离子液体的活化

取0. 001 mol 的离子液体，加入0. 001 2 mol 1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺及0. 111 5

molN- 羟基琥珀酰亚胺，在 5 mL 的吗啉乙磺酸溶液中，室温搅拌反应 2 h 后停止。

1. 3 活化的离子液体修饰 PPL

取2 g PPL 用去离子水溶解，向酶溶液中缓慢加入活化的离子液体，在 0 ～4 ℃ 下，磁力搅拌

6 h 后，在去离子水中透析 24 h 备用。修饰度的测量通过三硝基苯磺酸法才测定。

1. 4 蛋白质含量测定

按照 Bradford 的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白质绘制标准曲线。测定酶液的吸光值，根据

标准曲线计算蛋白浓度。

1. 5 酶活的测定

1) 三乙酸甘油酯乳化液的制备将6. 83 g 三乙酸甘油酯在强力搅动下缓慢加入磷酸缓冲液( pH7.

0) ，得到三乙酸甘油酯乳化液，再加入磷酸盐缓冲液定容至100 mL。

2) 酶活测定取 10 mL 上述制备的三乙酸甘油酯乳化液于 100 mL 锥形瓶中，再加入15 mL 磷酸

盐缓冲液( pH 7. 5) ，于 50 ℃、150 r/min 下预热 5min ，然后向其中加入酶开始反应。反应 10

min 后取出，立即加入15 mL 乙醇终止反应。用 0. 025mol / L 的NaOH 溶液滴定，记录 NaOH

的消耗量。

在一定条件下，每分钟酶催化三乙酸甘油酯生成 1μmol 乙酸所需要的酶量，定义为一个酶活单

位( U) 。

1. 6 最适温度及最适pH 的检测

1) 最适温度调节反应缓冲液pH 为7. 0 ，分别在30、35、40、45、50、55、60 和65 ℃ 下水浴

反应 10min，取出测定酶活。

2) 最适pH 调节反应液的 pH 分别为6. 0、6. 5、7. 0、7. 5 和8. 0，50 ℃ 下水浴反应 10 min，

取出测定酶活。

1. 7 酶的热稳定性

将酶置于50 ℃ 水浴中保温，分别在0、0. 5、1、2、4、6 和8 h 取出，冷却至室温，再测定酶

活。酶活测定方法同 1. 5 。设保温0 h 时的游离酶的初始酶活为 100%。

1. 8 有机溶剂耐受性

在酶活测定的反应体系中，加入不同浓度的有机溶剂，测定修饰前后PPL 在有机溶剂中的催化

稳定性，设不含有机溶剂体系游离酶的初始酶活为 100%。

1. 9 紫外光谱测定

室温下，取相同浓度的 PPL、PPL-M、PPL-E 和PPL-B 在紫外可见分光光度计上分别测定其紫

外可见吸收光谱，测定范围为240 ～340 nm。

2 结果与讨论

2. 1 水解活力的考察

表1 为经修饰后的酶与PPL 的表观比酶活力的数据。【表1】

由表1 可知: 猪胰脂肪酶在经过修饰之后，活力有明显的提高，说明离子液体修饰脂肪酶的方

法有利于水解活力的提高。其中离子液体修饰的酶，随着修饰度的增加活力增大，含短链的修

饰有更好的水解活力，是游离酶的 1. 74 倍，而邻苯二甲酸酐对 PPL 的修饰只提高了 25% 的水

解活力。随着修饰剂的链长的增大，活力呈降低的趋势。

2. 2 最适温度的考察

根据经典酸碱滴定的方法，在不同温度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，结果见图 1 。由图 1

可知: 原酶最适反应温度为 45 ℃左右; 经离子液体修饰后，PPL 的最适温度向高温方向移动至

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摘要：

功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶，广泛应用于水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前用途最广泛的酶催化剂之一。猪胰脂肪酶(porcinepancreaslipase，PPL)是一类重要的脂肪酶，在食品、化妆品、医药、洗涤剂和畜牧业等领域中均有广泛应用。然而，PPL的应用仍然存在一些不足，如一般具有实应用价值的目标化合物并不是它的天然底物;PPL活力不高，在有机溶剂、高温、极端pH等非天然环境下极易失活等，这些不利因素限制了PPL...

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