基因分型技术的原理、流程及其在植物领域的应用
基因分型技术的原理、流程及其在植物领域的
应用
摘要：随着高通量测序技术的发展, 一种高效而经济的 SNP (single nucleotide polymorphism)
发掘和基因分型技术 GBS (genotyping by sequencing) 被开发出来, 避免了传统基因型鉴别方法
的不足, 现已被广泛应用于植物遗传图谱构建、全基因组关联分析、基因多样性研究以及种质
鉴定和品种识别等多个领域。从 GBS 技术的原理、流程、特点以及应用等方面对近年来植物
应用 GBS 技术所进行的研究进展进行综述, 并提出了今后 GBS 技术的研究重点, 以期为 GBS 技
术在植物的应用研究提供参考。
Research Progress of GBS Technology in Plant
QIAO Yan SUN Jiaqing WEI Ruqian LIU Yue
Key Laboratory of Ethnomedicine, Ministry of Education, Minzu University of China College of Life
and Enviironmental Sciences, Minzu University of China National Resource Center for Chinese
Materia Medica, China Academy of Traditional Chinese Medicine
Abstract：With the development of high throughput sequencing technology, GBS (genotyping by
sequencing) technique, an economic technique to discover SNP and genotype myriad of crop
germpasms in an effective way, has been developed, which avoids the deficiency of traditional
genotypic identification methods. It has been widely used in many fields including construction of
genetic map, genome-wide association study, genetic diversity and germplasm dentification and
variety identification. In this paper, the research progress of GBS technology in plants was reviewed
from the principle, process, characteristics and application. And the research emphasis on GBS
technology was putting forward in the future, which was expected to provide reference for the future
research of GBS technology on plants.
伴随着新一代测序技术的逐渐成熟，高通量测序技术，又称为下一代测序技术，逐渐被广泛认
可和利用，并为植物基因组学研究提供充分信息[1]。下一代测序技术提供的数据信息为遗传信
息的发掘和基因表达调控等基础性研究做出了很大的贡献。简化基因组测序技术
(reducedrepresentation sequencing) 是目前比较高效的适用于群体分析的手段，已有的方法主要
有限制性片段长度多态性、扩增片段长度多态性等[2]。而新型的基因分型方法基于测序基因分
型技术 (genotyping by sequencing, GBS) ，由于其快速、简便、低成本等优点逐渐被应用于多种
植物的研究中[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。为了更好地了解和应用 GBS 技术，本文
从原理、技术流程、特点以及应用领域 4个方面对近年来 GBS 技术研究进展进行综述，以期为
以后 GBS 技术的改良以及在植物领域更好地应用提供参考。
1 GBS 测序技术的原理
GBS 技术是目前较为常见的一种简化基因组测序技术[3]。该技术通过测序进行基因分型，其
命名是为了与传统的通过芯片进行基因分型的方法相区别，原理是将基因组 DNA 进行酶切，
然后对酶切片段进行高通量测序，通过分析获得 SNP 信息并进行基因分型的分子标记的方法
[4] 。
为确定样本的基因分型，GBS 技术将样本的基因组利用物理手段 (如超声波等) 或者选用内切
酶对 DNA 进行酶切，将其打断成一些小的片段，然后对带有标签序列的小片段进行富集，对
利用高通量测序技术测得的小片段两端的序列进行数据分析得到被测基因组大量的 SNP 信息，
原理如图 1 所示。该技术可以根据研究的灵活性来调整捕获酶切位点所需的片段 (tags) 的数
量，从而控制捕获序列的范围，极大地降低了遗传多样性较高物种的研究挑战性。
图1 GBS 测序技术原理[3]
2 GBS 技术关键流程
2.1 限制性内切酶选择
提取所研究物种 DNA 后，应用限制性内切酶进行酶切。根据所研究植物的 DNA 序列特点，选
择合适的限制性内切酶对 DNA 进行切割。Ape KⅠ 酶在所研究物种中的应用频率是最高的，该
Ⅱ酶是一种 型限制性内切酶，在所研究物种 DNA 的转座子区几乎没有识别位点，且部分甲基化
敏感，如果两条链上识别序列 3'-端的碱基是 5'-甲基胞嘧啶则不会被限制性内切酶切断，从而
避免了 DNA 片段长度过短的问题[3]。Ape KⅠ 酶广泛应用于玉米、大麦、小麦、大豆等作物。
对目前应用 GBS 技术在植物中使用的限制性内切酶进行总结归类，由于四碱基酶在 DNA 样品
中的切割相对频繁，得到的片段最小，有益于下一步的处理，因此已有的研究中四碱基酶的利
用相对较多。GBS 技术限制性内切酶种类如表 1 所示。
在开发 GBS 技术的时候，通常会遵守以下三个原则: (1) 尽量避开重复序列; (2) 酶切位点在基因
组上均匀分布; (3) 根据研究的目的，灵活地调整所需要的酶切位点的片段数量 (tags) [1] 。
表1 GBS 技术限制性内切酶种类
2.2 测序文库的构建
GBS 文库构建过程中，在应用限制性内切酶进行酶切后，在酶切片段两端加上带 Barcode 接
头，对每个样品进行 PCR 扩增，然后对样品进行混合，选择需要的片段构建文库，利用
Illumina Hiseq 测序平台进行末端测序。GBS 文库构建过程如图 2 所示。
2.3 数据分析
GBS 技术的应用可以通过有无参考基因组分为两类，对于有参基因组的物种可以将测序结果与
基因组对比进行多态性鉴别[42]。对得到的 Raw Data 进行质量控制得到 Clean Data，将其与参
考基因组进行比对，根据比对结果对 SNP 进行检测和注释。对于没有参考基因组的物种来说，
想要获得大批量SNP 数据存在着一定的限制，GBS 方法从技术上解决了这一问题，原理为利
用合适的限制性内切酶对完整的基因组 DNA 进行酶切，之后利用序列信息标识来源不同的基
因型个体，利用测序得到的信息将不同个体短序列进行聚类，通过序列分析得到 SNP 位点在群
体中的变异位点[23]。对 SNP 可以进行群体遗传结构分析，主要包括系统进化树的构建、主成
分分析和群体结构分析。以及对群体遗传多样性进行分析，包括 Ho (观测杂合度) 、He (预期
杂合度) 和核苷酸多样性分析[13] 。
图2 GBS 文库构建流程
2.4 GBS 技术的特点
RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等传统鉴别基因型的方法已广泛应用于许多方面，但需要耗费巨
大的人力财力，所需实验时间长，并且在基因组中的丰富性较差。GBS 是一种简化基因组测序
技术，避免了传统方法的一些不足。虽然不足以覆盖全基因组深度，但是由于其省时、价廉、
有效的特点而得到普及[1]。GBS 技术在发展之初就是为了降低较大基因组测序的复杂程度，
其设计原理上的优势主要体现在: (1) 测序前无需了解基因组的信息; (2) Barcode 的长度为 4～8
碱基，允许连接成百上千的DNA 样品进行测序，减少了基因型鉴定的时间; (3) 限制性内切酶
的选择，可以控制酶切片段的长度，简化了基因组的富足性，便于进行下一代测序; (4) 从成本
方面进行考虑，实验所需的酶体系可以自己配置，与购买试剂盒相比，便宜10 倍之多，更有
利于高密度SNP 鉴定[16] 。
如今 GBS 技术已广泛应用于大豆、大麦、小麦等基因组较大、重复度较高的生物上，并在诸
多方面进行了改良。Sonah 等[14]对豆科植物进行研究，降低基因复杂度，对 GBS 技术进行改
进，在 8个遗传多样性的大豆中开发 10 120 个高质量 SNP 标记，且其分布接近基因丰富的区
摘要：
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基因分型技术的原理、流程及其在植物领域的应用 摘要：随着高通量测序技术的发展,一种高效而经济的SNP(singlenucleotidepolymorphism)发掘和基因分型技术GBS(genotypingbysequencing)被开发出来,避免了传统基因型鉴别方法的不足,现已被广泛应用于植物遗传图谱构建、全基因组关联分析、基因多样性研究以及种质鉴定和品种识别等多个领域。从GBS技术的原理、流程、特点以及应用等方面对近年来植物应用GBS技术所进行的研究进展进行综述,并提出了今后GBS技术的研究重点,以期为GBS技术在植物的应用研究提供参考。ResearchProgressofGBSTechn...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
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时间：2024-04-20
