枯草芽孢杆菌嘌呤合成路径的优化对腺苷积累的作用

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枯草芽孢杆菌嘌呤合成路径的优化对腺苷积累

的作用

腺苷( Adenosine) 化学名为 6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，在医药和食品领域有广泛的应

用。早在 20 世纪 50 年代，应用微生物发酵法生产腺苷的研究就已经开始，但是对腺苷研究的

报道主要集中在菌种的选育和培养基的优化，使用基因工程技术改造腺苷生产菌的研究却很

少。本实验室保藏的腺苷生产菌 Bacillus subtilisXGL，是通过长期诱变筛选而成，但是进一步

诱变对产苷影响不大，要获得更加优良的菌株，需要利用新的方法对其进一步改造。

前期研究显示，对嘌呤合成途径改造，改变途径中关键酶的活性进而影响嘌呤合成速率，可以

有效地提高肌苷、核黄素的产量。因此，嘌呤合成途径的强弱直接影响核苷类物质的合成。嘌

呤合成途径的重要中间代谢物肌苷酸( IMP) 是腺苷合成的直接前体物，肌苷酸的供应很可能是

工程菌中腺苷合成通量的主要限制因素之一。因此，增加葡萄糖到 IMP 的合成途径通量能够提

高腺苷合成中前体物的供应，继而促进腺苷的积累。

在枯草芽孢杆菌中，嘌呤核苷酸合成相关的基因组成嘌呤操纵子，嘌呤操纵子( purEKB-

purC( ORF) QLF-purMNH( J) -purD) 全长 13339 bp，由于嘌呤操纵子整体较大，而嘌呤合成途

径中关键酶 PRPP 转酰胺酶编码基因 purF 位于嘌呤操纵子的中下游，距离启动子较远，转录效

率不高。因此本研究以 B ．subtilis XGL 为出发菌株，以温敏质粒 pKS1 为骨架，构建整合质

粒pKF ，利用单交换的方式将强启动子 P43 插入至嘌呤操纵子中，不仅过表达了嘌呤合成途径

中关键酶 PRPP 转酰胺酶编码基因 purF ，而且其下游基因 purM、purN、purH 和purD 表达水

平也得到不同程度的提高。这些相关基因的共同表达将比单一增强表达 purF 基因催化更多的

嘌呤前体物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氢叶酸进入嘌呤途径，将更加有效地提高嘌呤合成

途径通量。

1 、材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌株和质粒: 表1 为本研究所用菌株和质粒。

1. 1. 2 引物: 表2 为本研究使用的引物，均由 Primer Premier 5. 0 软件设计。

1. 1. 3 培养基:①种子培养基( g/L) : 葡萄糖 20 ，酵母粉 5 ，味精 5 ，蛋白胨 8 ，尿素 5 ，黄嘌呤

0. 03，L- 组氨酸 0. 03，MgSO4·7H2O 0. 4，KH2PO41 ，玉米浆 25mL ，豆饼水解液 10 mL，pH

7. 0。②摇瓶发酵培养基( g/L) : 葡萄糖 80 ，味精 10 ，黄嘌呤 0. 03，L-组氨酸 0. 03 ，酵母膏

5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0. 4，( NH4)2SO45，CaCO320 ( 干热灭菌) ，豆饼水解液 15

mL ，玉米浆 15 mL，pH 6. 7 ，灭菌条件均为 115℃ ，15 min 。培养基必要时添加5 μg / mL 的

红霉素。③发酵罐发酵培养基( g/L) : 葡萄糖 80 ，味精 12 ，酵母膏18 ，葡萄糖酸钠1. 5，黄嘌

呤0. 03，L-组氨酸 0. 03，( NH4)2SO412，MgSO4·7H2O 5，K2HPO42，MnSO40. 06，FeSO40.

06，CaCl22 ，玉米浆 15 mL，pH6. 7 。其中葡萄糖分消灭菌，灭菌条件均为 115℃ ，15 min。

工程菌种子培养基添加5 μg / mL 的红霉素。

1. 1. 4 主要试剂和仪器: Solution I 连接酶和 RNA 提取试剂盒，大连宝生物工程有限公司; Taq

DNA 聚合酶，北京全式金生物技术有限公司; 限制性内切酶和 1 kb DNA marker，Fermentas 公

司; UltraSYBR 二步法荧光定量PCR 试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司; 质粒小量快速

提取试剂盒，北京博迈德生物技术有限公司; PCR 产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒，北京天恩

泽基因科技有限公司; 引物合成与基因测序，北京华大基因。实时定量PCR 仪，美国 ABI 公

司; 电穿孔仪，Eppendorf 公司; 高效液相色谱系统，美国安捷伦公司。

1. 2 感受态的制备及转化

枯草芽孢杆菌的制作方法与转化方法参考文献，载体连接化学转化感受态制备及质粒连接体系

转化均参照连接试剂盒和化学转化试剂盒说明书进行。

1. 3 实时定量PCR 分析

将B ．subtilis XGL 和B ．subtilis XGLF 菌株接于 5 mL 摇管过夜培养，以 1% 的接种量接种于

30 mL 的LB 培养基中培养至对数期，按照 RNA 提取试剂盒说明书提取总 RNA，利用反转录

试剂盒获得 cDNA ，并以之为模板，以细菌16S rRNA 为参比，通过实时定量PCR ，根据 2 －

ΔΔCT 法计算相关基因的转录水平。

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摘要：

枯草芽孢杆菌嘌呤合成路径的优化对腺苷积累的作用腺苷(Adenosine)化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，在医药和食品领域有广泛的应用。早在20世纪50年代，应用微生物发酵法生产腺苷的研究就已经开始，但是对腺苷研究的报道主要集中在菌种的选育和培养基的优化，使用基因工程技术改造腺苷生产菌的研究却很少。本实验室保藏的腺苷生产菌BacillussubtilisXGL，是通过长期诱变筛选而成，但是进一步诱变对产苷影响不大，要获得更加优良的菌株，需要利用新的方法对其进一步改造。前期研究显示，对嘌呤合成途径改造，改变途径中关键酶的活性进而影响嘌呤合成速率，可以有效地提高肌苷、核黄素的产...

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