酶标板法检测TG净含量的优化方法
酶标板法检测 TG 净含量的优化方法
甘油三酯(triglyceride,TG)是人体内含量最多的脂类,是体内能量的主要来源.TG 检测是一项重要
的临床血脂常规测定指标. 血清甘油酯测定方法可分为化学法、酶标板法和色谱法 3 大类.化学
法因操作步骤繁多、技术要求高而不适于常规工作应用.
核素稀释 / 气相色谱 / 质谱技术(ID / GC / MS)主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物
质的制备与定值,该方法费用昂贵,样品处理复杂,难以推广应用.酶标板法具有简便快速、微量、
精密度高的优点,且特异性强,易于达到终点,线性范围宽,故临床实验室应用最为广泛[1].
武汉生物制品研究所有限责任公司(以下简称武汉公司)血液制剂研究室研发的人血浆蛋白层析
法纯化工艺,主要过程为原料血浆经过各种亲和层析及离子交换层析等步骤,依次获得多种血浆
蛋白制品.杂质是影响血液制品特性及质量的重要因素.研发过程中曾发现层析法纯化的人血白
蛋白(humanserum albumin,HSA)巴氏灭活后有不同程度的浑浊,但巴氏灭活前后样品中白蛋白
(albumin,ALB)的含量未见明显变化,可能为血浆中的脂类析出.为了提高产品质量,我们对工艺样
品的 TG 净含量进行监控,并以此指标来指导工艺的优化.经检测发现, 工艺样品中确实含有 TG,
采用去脂剂(lipid removal agent,LRA)优化工艺去除后,人血白蛋白原液外观为澄明液体,符合《中
国药典》三部(2010 版)相关规定[2].
本实验优化了酶标板法检测 TG 净含量的方法,进行验证后,将其应用于监测人血白蛋白层析纯
化工艺中样品的脂类含量,对工艺优化提供了指导.
1 材料与方法
1. 1 样品 4 批原料血浆样品包括 13001、13002 批血浆和 13003、13004 批冷沉淀上
清;201307003 及201307004 批人血白蛋白纯化工艺样品包括原料血浆、血浆过滤后、纤维蛋白
溶解酶原的亲和层析流穿液(Pg-FT)、纤维蛋白原亲和层析的流穿液(Fg-FT)、IgG 亲和层析的流
穿液(IgG-FT)( 加LRA 前)、白蛋白亲和层析上柱液(ALB-Load, 加LRA 后样品)、Alb 洗脱液
(ALB-Elu);LRA 小试样品 13004 LRA2-61、13004LRA2-62,均由本公司血液制剂研究室提供.
1. 2 标准品 标准品[TG 及游离甘油(free glycerin,FG) 的起始浓度分别为 2. 5 和0. 26 mg / ml],批
号:SLBF4338, 为美国Sigma 公司产品.
1. 3 主要试剂及仪器 TG 试剂盒(批号:SLBD0025)[内含 FG 检测试剂,批号:SLBB4986V;TG 检测
试剂,批号:SLBB9109V]及LRA(批号:39339V)均为美国Sigma 公司产品;多功能酶标仪
SpectramaxPlus384 及分析软件 SoftMaxPro.5.2 为美国MolecularDevices 公司产品.
1. 4 酶标板法检测 TG 净含量方法的建立 1. 4. 1 FG 检测试剂和 TG 检测试剂的处理 按试剂的标
示量用注射用水分别将试剂盒中的 FG 和TG 检测试剂复溶,迅速颠倒混匀, 置2 ~ 8 ℃避光保存.
1. 4. 2 标准品及质控品溶液的制备 将标准品平衡至室温, 用注射用水进行 2 倍系列稀释, 共8 个
稀释度,TG 浓度从2 500 ~ 19. 5 μg / ml. 用注射用水按 1 5 ∶ 和1 10 ∶稀释标准品, 制备 2 个质
控品,浓度在标准品系列的中段,TG 浓度分别为 500 和250 μg / ml.
1. 4. 3 样品处理 样品可直接用于检测,如检测结果高出检测范围,则稀释样品直至检测值在线性
范围内.
1. 4. 4 检测方法 开启酶标仪Softmax 软件的脂类-TG 测定模板, 设定波长为540 nm,开启加热功
能, 使装微量滴定板的托盘预温到37 ℃,并持续在 37 ℃保温. 分别取50 μl 注射用水(空白)、标准
品系列、质控品系列或样品加至相应的反应管中, 每管加入FG 检测试剂 0. 8 ml, 混匀 2 ~ 3 s 后,
转移至 96 孔板,200 μl / 孔, 每个样品作 3 个复孔,将96 孔板置于酶标仪托盘中,(37 ± 1)℃ 孵育 5
min, 用酶标仪检测 A540 值, 此为 FG 的吸收值; 第1 次读数结束, 取出96 孔板, 加入TG 试剂,50
μl / 孔,混匀, 同上进行第2 次孵育和读数, 此为 TG 的吸收值.
1. 4. 5 结果计算 以标准品系列的FG 浓度为横坐标, 以相应浓度的 FG 吸收值为纵坐标, 绘制FG
含量标准曲线,按一次方程拟合标准曲线,计算线性的相关系数, 并计算质控品中的 FG 含量;以标
准品系列的TG 浓度为横坐标, 相应浓度的 TG 吸收值为纵坐标, 绘制TG 含量标准曲线,按一次方
程拟合标准曲线,计算线性的相关系数,并计算质控品中的 TG 含量.TG 含量减去FG 含量即为
TG 净含量.
1. 5 方法的验证
1. 5. 1 标准曲线线性范围的确立 将标准品作 2倍稀释系列( 共7 个稀释度), 使TG 浓度从2 500
~19. 5 μg / m(lS1 ~ S7),作为标准品系列;将标准品一步稀释至不同浓度(1 500、500、234. 5、58.
5 μg / mlTG)覆盖在标准曲线的高值和低值区作为质控品系列(C1 ~ C4).每个浓度的样品重复测
定3 次,计算各浓度样品的吸光度均值, 分别以 FG 和TG 的浓度对其相应的吸光度值做线性回
归,R2 应均不低于0. 99,各个稀释度的变异系数(CV) 不大于 15%. 计算 2 条标准曲线下各稀释度
质控品的 FG 和TG 的回收率( 可接受标准为 90% ~ 110%),确定标准曲线的线性范围.
1. 5. 2 准确度 取TG 浓度为 2 500 μg / ml 的标准品和样品 13004LRA2-62, 以0 1∶、1 7∶、1
3 ∶ 和1 1(∶即低、中、高浓度)的比例混合,按建立的方法进行检测. 取平均值计算样品中
FG、TG 含量及 TG 净含量,并计算回收率( 可接受标准为 90% ~ 110%).
1. 5. 3 精密度 1. 5. 3. 1 重复性 取样品 13004LRA2-61,按建立的方法,由同一个实验员在同一试验
中连续测定 6 次, 计算 CV( 可接受标准为 CV ≤ 10%).
1. 5. 3. 2 中间精密度 取样品 13004LRA2-61,按建立的方法,由不同的实验员在不同日期内分别测
定3 次, 计算 CV( 可接受标准为 CV ≤ 10%).
1. 6 方法的初步应用
1. 6. 1 TG 含量的检测在蛋白纯化工艺中的应用用建立的方法检测 4 批混合原料血浆中的 TG 净
含量,初步建立工艺数据; 检测 201307003 和201307004 批中间品(原料血浆、Pg-FT、Fg-
FT、IgG-FT) 的TG 净含量, 监测工艺流程中 TG 的流向.
1. 6. 2 LRA 在白蛋白纯化工艺中的应用 取201307004 批IgG-FT,采用低温乙醇法制备白蛋白常
用的硅藻土浓度,处理样品, 经1 μm 滤膜过滤后,收集上清; 取同批 IgG-FT, 加入不同量的
LRA(A、B、C 方案),LRA 用量:A 方案= C 方案< B 方案,搅拌时间:A 方案< B 方案= C 方案,
经1 μm 滤膜过滤后,收集上清. 用建立的方法检测 TG 净含量,分析各组检测结果, 获得 LRA 最佳
应用条件.
2 结 果
2. 1 酶标板上的 TG 净含量检测方法的建立 检测结果显示,FG 的标准曲线线性回归方程为 Y =
0. 002 +0. 003 93 X,R2= 0. 999;TG 的标准曲线线性回归方程为 Y = 0. 061 2 + 0. 000 407 X,R2=
1;2 个质控品系列的回收率在 90% ~ 110%,CV < 10%.表明由传统的试管法改为酶标板法是可行
的.因为 S-8 的A540 值极低, 且CV > 10%,故标准曲线范围暂定在S-1 ~ S-7.
2. 2 方法的验证
2. 2. 1 线性范围 FG 的标准曲线线性回归方程为:Y = 0. 005 25 + 0. 004 11 X,R2= 0. 997;TG 的标
准曲线线性回归方程为:Y = 0. 009 74 + 0. 000 427 X,R2= 0. 997. 质控品 4(TG:58. 5 μg / ml,FG:6
μg / ml)回收率不合格,因此,确定该方法检测的线性范围在S-1 ~ S-6 ( 即TG:78 ~ 2 500 μg /
ml;FG:8. 13 ~260 μg / ml)之间. 见表1 和表2.
摘要：
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酶标板法检测TG净含量的优化方法甘油三酯(triglyceride,TG)是人体内含量最多的脂类,是体内能量的主要来源.TG检测是一项重要的临床血脂常规测定指标.血清甘油酯测定方法可分为化学法、酶标板法和色谱法3大类.化学法因操作步骤繁多、技术要求高而不适于常规工作应用.核素稀释/气相色谱/质谱技术(ID/GC/MS)主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值,该方法费用昂贵,样品处理复杂,难以推广应用.酶标板法具有简便快速、微量、精密度高的优点,且特异性强,易于达到终点,线性范围宽,故临床实验室应用最为广泛[1].武汉生物制品研究所有限责任公司(以下简称武汉公司)血液制剂研究室...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
价格：免费
属性：5 页
大小：150.2KB
格式：DOCX
时间：2024-04-20
