能分离、检测分子量跨越范围大的多个蛋白的一步法电泳

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能分离、检测分子量跨越范围大的多个蛋白的

一步法电泳

肌联蛋白（titin）是一个肌小节蛋白，发现相对较晚，但功能重要.Titin 是哺乳动物体内分子量

最大的蛋白，随亚型结构不同分子量达 2970-3700kDa.Titin 的N-C 末端跨越半个肌小节，N末

端与肌动蛋白相互作用固定于 Z线，C末端附着在 M线的肌球蛋白上。

Titin 的发现是对滑行肌丝模型理论（sliding filament model “）的重要补充，是肌原纤维中的第

”三肌丝 .其结构特点有利于维持肌原纤维的完整性和稳定性，为粗肌丝装配的模版蛋白.并

且，titin 的I带部分具有高度折叠的弹簧样分子结构，是心肌细胞执行舒张功能的重要结构基

础.Titin 在心肌细胞中同时表达N2B 和N2BA 两种亚型，N2B 更短更僵硬，N2BA 更长更

有弹性，在不同的种属、不同的发育阶段和病理状态下，N2B/N2BA 比值变化，可导致心脏僵

硬度发生明显的改变.为研究 titin 的生理病理功能，需对 titin 及其亚型进行有效的电泳分离。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electropho-resis,SDS-PAGE）是分离鉴别蛋

白的重要实验方法，但该方法不能有效地分离大于 500KDa 的大分子量蛋白，对于超大分子量

的titin 而言需要特殊的电泳技术.本试验为能同时有效地分离肌小节内的超大分子量蛋白 titin 各

亚型和中分子量的肌球蛋白重链（Myosin heavy chain,MHC），增强 titin 研究的可行性和科学

性，对其电泳方法进行了改良。

采用大面积垂直电泳，在电泳板上层以 SDS-琼脂糖胶（SDS-agarose gel electrophoresis,SDS-

VAGE）方法分离 titin 各亚型，下层以 SDS-PAGE 电泳分离 MHC,建立了能够同时分离、检测

分子量跨越范围大的多个蛋白的一步法电泳。

材料和方法

1.材料

1.1 仪器与试剂

DYY-60 型电泳仪；16cm×18cm 垂直凝胶电泳槽（Bio-rad,美国）；凝胶成像系统（KODAK,美

国）；琼脂糖（SeaKem Gold AGAROSE,Sigma,美国）；四甲基乙二铵（Sigma,美国）；丙烯

酰胺、硝酸银、硅钨酸、冰醋酸、甲醛、甘油、甘氨酸、十二烷基苯磺酸钠（SDS）、

三羟甲基氨酸甲烷（Tris）、过硫酸铵（Aps）等。

1.2 实验材料

实验兔和小鼠，均于麻醉后迅速摘取心脏，用冰生理盐水冲洗，沿房室环剪去左右心房及右室

游离壁，然后切取左心，心尖至心底连线中点处游离壁心肌组织，置液氮保存后转移至-80℃

低温冰箱以备做。同样方法留取兔腓肠肌组织。

2.方法

2.1 总蛋白提取

取少量的上述的兔心肌组织、小鼠心肌组织，兔腓肠肌组织。将各组标本分别置于预冷的研钵

中，在液氮浸泡下将组织块研磨成粉状。将粉状组织分装入EP 管中，并按1 40∶移入裂解

液。60℃加热 10min.涡旋后，在 13 200r/min 离心 5min,取上清即行电泳。

2.2 垂直凝胶板的制备

将两块16cm×18cm 的垂直电泳玻板和齿梳洗净后，再用酒精擦拭，晾干，安装在配胶架上。

2.2.1 配制PAGE 胶

先配制15ml 6 %的PAGE 胶，配方如下：30%丙烯酰胺溶液 3ml、2mol/L Tis（pH 8.8）5.7ml、

甘油 0.15 ml、Aps 0.15 ml、去离子水 6 ml、TEMED 0.012ml、SDS 0.15ml.配置后立即混匀，

迅速将配置好的PAGE 胶灌注到两块玻璃板中间的间隙中，小心地用双蒸水覆盖，室温垂直放

置1h 使之凝固。PAGE 胶高度约占整片垂直电泳胶的 1/3,主要起到分离中分子蛋白 MHC 的作

用，同时可防止在垂直电泳中上层 VAGE 胶从底部脱落。待PAGE 胶聚合完成后，倒掉覆盖

层，尽可能排去凝胶上的液体，用吸水纸吸干。并将带有 PAGE 胶的垂直电泳槽置于60℃烤箱

中预热约 15min.

2.2.2 配制VAGE 胶

VAGE 胶灌注在PAGE 胶上方，约占整片垂直电泳胶的 2/3,主要起到分离巨大分子 titin 亚型的

作用。按照下述方法配制50ml 1 %的VAGE 胶：100%甘油 15ml,5#buffer（0.25mol/L

Tris,1.92mol/L 甘氨酸，0.5% SDS）10ml,去离子水定容至 50ml.秤取琼脂糖 0.5g,将上述50ml 溶

液溶解琼脂糖。反复煮沸，使琼脂糖充分溶解。其后将琼脂糖液置入 60℃烤箱 10min,以排除液

体中的气泡。将1% VAGE 胶直接灌注到已预热的垂直电泳槽中，灌注后再次放入 60℃烤箱 5-

10min,使液状胶体中的气泡能上升至液面。取出已灌注的垂直电泳槽，排除气泡后，立即在其

中插入一块干净的齿梳。室温冷却后置于4℃冰箱制冷，至少放置 30min 后方能行电泳。也可

于4℃冰箱中放置不超过 2d.

2.3 点样

待VAGE 胶聚合冷却后，小心移去齿梳。将凝胶固定在电泳装置上，分别在上下电泳槽加入蛋

白质电泳缓冲液，缓冲液配方：50mmol/L Tris,0.384mol/L 甘氨酸，0.1% SDS,上槽中需添加

0.08%2-巯基乙醇。排除气泡后按照预定顺序每个样品上样 10μl,不用上样的空孔加入等体积的

2×SDS 凝胶上样缓冲液。

2.4 电泳

在恒温 4℃下进行电泳。接通电源，设定电压为200-250v, 恒定电流15 mA. 当溴酚蓝到达

下层 PAGE 胶体底部时，可停止电泳，约需持续电泳 5h.卸下玻板，在缓和的流水中轻轻撬

开，取出凝胶。小心分离出下层的 PAGE 胶和上层的 VAGE 胶。

2.5 染色

PAGE 胶使用考马斯亮蓝染色法：用至少 5倍体积的考马斯亮蓝 R250 染色液浸泡 PAGE 胶，

室温下置于摇床上平缓摇动1h.将凝胶移入脱色液中，室温平缓摇动4-8h,其间更换脱色液 2-3

次；VAGE 胶使用银染法：使用100 ml 固定液浸泡VAGE 胶，室温下置于摇床上平缓摇

动1h.弃除固定液后，置胶片于37℃118-20h,使胶片中水分减少，胶片变薄可降低银染时背景对

结果观察的影响。蒸馏水摇晃洗涤20min×3 次。2 %亚铁氰化钾浸泡 5min 后，蒸馏水摇晃洗涤

5 min×3 次。100ml 新鲜配制的银染液染色，待蛋白条带出现即倒掉银染液，予1%冰乙酸液洗

胶，中和停止银染反应。

2.6 上述凝胶均于染色后即扫描记录，使用Bandscan 分析软件对目标条带行蛋白定量。

结果

Titin 为动物体内分子量最大的蛋白，使用SDS-VAGE 电泳并银染可见titin 的蛋白条带

处于胶片的最顶端。Titin 具有数个亚型，亚型的数量比例在不同的物种中差别甚远。因为兔腓

肠肌titin 基本为 N2A 亚型，鼠心肌 titin 99 %为N2B 亚型，所以可使用这两种组织的titin 电泳

条带作为 tit-inN2A 和N2B 亚型的标记.蛋白电泳结果显示：采用改良后的电泳方法，上层 SDS-

VAGE 胶能成功分离 titin,银染后可清晰显示titin 各亚型及其分解产物T2.使用兔腓肠肌作为

titin N2A 标记，鼠心肌作为 titin N2B 标记，可确定兔心肌细胞分离出N2B 和N2BA 亚型，titin

各亚型相应条带所处位置与其分子量大小一一对应（图1）.

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摘要：

能分离、检测分子量跨越范围大的多个蛋白的一步法电泳肌联蛋白（titin）是一个肌小节蛋白，发现相对较晚，但功能重要.Titin是哺乳动物体内分子量最大的蛋白，随亚型结构不同分子量达2970-3700kDa.Titin的N-C末端跨越半个肌小节，N末端与肌动蛋白相互作用固定于Z线，C末端附着在M线的肌球蛋白上。Titin的发现是对滑行肌丝模型理论（slidingfilamentmodel“）的重要补充，是肌原纤维中的第”三肌丝.其结构特点有利于维持肌原纤维的完整性和稳定性，为粗肌丝装配的模版蛋白.并且，titin的I带部分具有高度折叠的弹簧样分子结构，是心肌细胞执行舒张功能的重要结构基础.Tit...

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