酿酒酵母基因编辑的主要技术成果探究
酿酒酵母基因编辑的主要技术成果探究
摘 要： 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 是代谢工程中最重要的宿主之一，先进的基
因编辑技术已经被广泛应用于酿酒酵母细胞工厂的设计和构建。随着基因编辑技术的飞速发
展，早期基于重组酶和同源重组的基因编辑技术逐渐被新型基因编辑系统所替代。文中对酿酒
酵母基因编辑技术的原理和应用进行了总结，包括经典的酿酒酵母基因编辑技术，基于核酸内
切酶的 MegNs、ZFNs 和TALENs 等基因组编辑系统，最后介绍和讨论了基于 CRISPR/Cas 系
统、异源代谢途径多拷贝整合和基因组规模基因编辑的最新研究进展，并对酿酒酵母基因编辑
技术的应用前景和发展方向进行了展望。
Abstract： Saccharomyces cerevisiae is one of the most important hosts in metabolic
engineering. Advanced gene editing technology has been widely used in the design and construction of
S. cerevisiae cell factories. With the rapid development of gene editing technology, early gene editing
technologies based on recombinase and homologous recombination have been gradually replaced by
new editing systems. In this review, the principle and application of gene editing technology in S.
cerevisiae are summarized. Here, we first briefly describe the classical gene editing techniques of S.
cerevisiae. Then elaborate the genome editing system of MegNs, ZFNs and TALENs based on
endonuclease. The latest research progress is especially introduced and discussed, including the
CRISPR/Cas system, multi-copy integration of heterologous metabolic pathways, and genome-scale
gene editing. Finally, we envisage the application prospects and development directions of
Saccharomyces cerevisiae gene editing technology.
Keyword ：Saccharomyces cerevisiae; gene editing; CRISPR; multi-copy integration;
为实现生物能源、精细化学品和天然产物等的绿色、可持续制造，利用代谢工程与合成生物学
方法构建细胞工厂是一种有前途的策略[1]。作为一种典型的真核生物系统，酿酒酵母
Saccharomyces cerevisiae 具有优良的鲁棒性、对苛刻发酵条件的耐受性、基因工程操作的高效
性和公认的安全性(Generally recognized as safe,GRAS)，在学术研究和工业发酵中已经得到了广
泛应用[2,3,4]。早期酿酒酵母主要用于发酵面制品(如面包、馒头、包子)和酒精饮料(如啤酒、
米酒)等的生产，这一特性被很快用于燃料乙醇和单细胞蛋白的发酵生产。随着代谢工程技术
的发展，酿酒酵母被越来越多的用于生产有机酸、氨基酸、核苷酸、药用蛋白、工业酶制剂和
多不饱和脂肪酸(PUFAs)[5]等，这些产品被广泛应用于食品、医药、饲料和化工行业[6]。此
外，酿酒酵母在天然产物的微生物异源合成方面也显示出了独特的优势。与原核生物相比，酿
酒酵母具有较为完整的翻译后修饰系统和细胞器系统(例如线粒体、过氧化物酶体、内质网、
高尔基体和液泡)，为天然产物的生物合成提供了不同的环境和间隔[7,8]，特别是在异源表达复
杂代谢途径以及表达膜结合蛋白细胞色素 P450 氧化酶时表现出优越的能力[9,10,11,12,13]。目
前，多种植物次生代谢产物已经在酿酒酵母中实现合成，如生物碱[11]、芳香氨基酸[14]、萜
类[15]和黄酮类[16]等。最成功的例子是抗疟药物青蒿素前体物青蒿酸在酿酒酵母中的合成，
产量高达 25 g/L，并已实现工业化生产[17]。
“设计-构建-测试- ”学习是代谢工程的一般过程和实现细胞工厂构建预期目标的必经之路[18](图
1)。其中，构建是验证设计的必要手段。然而，随着越来越多的化合物在酿酒酵母中实现合
成，细胞工厂的构建与途径优化过程也暴露出了缺陷和局限，例如需要在单一位点进行多次操
作[14]，这已成为代谢工程的限速步骤。因此，开发高效的基因编辑工具势在必行。基因编辑
技术是对目标基因组位点进行特异性修饰，包括基因敲除、敲入、替换和有义的点突变[19]。
基因编辑技术在现代生物技术中起到至关重要的作用，其要求对基因和基因组预定位置进行精
确高效的编辑和修饰[20,21]。传统的基因编辑技术是根据 DNA 同源重组(Homologous
recombination,HR)原理，利用外源供体基因片段敲除或敲入目标基因片段，但这种方法效率较
低，发生基因重组的概率在10–9–10–6[22]。酿酒酵母中常用的基因编辑系统是 Cre/Lox P 系
统，同样是基于同源重组原理的基因编辑技术[23]。为了提高基因重组的效率，基因组双链断
裂已经被证明有助于提高同源重组发生的概率[24,25]。基于此，新型基因编辑技术已经被开发
利用，主要包括 4种：归巢核酸内切酶(Meganucleases,Meg Ns)系统、锌指核酸酶(Zinc finger
nucleases,ZFNs)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector
nucleases,TALENs)系统和 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关
的系统(表1)[19]。这些新技术的开发和应用，极大地促进了代谢工程与合成生物学的发展。本
文对酿酒酵母基因编辑技术的发展和现状进行了总结，包括早期基因编辑技术、新型编辑技术
和高通量编辑技术等。并对酿酒酵母基因编辑技术的发展前景进行了展望。
图1 酿酒酵母细胞工厂构建
Fig.1 Construction of S.cerevisiae cell factory.
表1 基因编辑技术在酿酒酵母中的应用
1 、酿酒酵母经典基因编辑技术
20 世纪 70 年代，基因工程的发展为基因组编辑开辟了新途径[35]。早期酿酒酵母基因编辑技术
主要基于同源重组和筛选标记。其中，同源重组技术利用未损伤的同源 DNA 片段作为模板，
以实现目标基因的添加、替换或失活[36]。这种经典的基因组编辑技术已在细胞工厂构建中得
到了广泛应用。在酿酒酵母中主要存在两种机制参与DNA 双链断裂修复：同源重组
(Homology-directed repair,HDR)(图2A)和非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)(图
2B)[24]。HDR 是利用带有目标基因同源序列的DNA 对目标位点实现精确的基因编辑。而
NHEJ 则是细胞自身在一些修复元件的作用下随机的修复过程，这可能造成基因组碱基的插入
和缺失，导致基因开放阅读框突变[37]。
随后，可以实现选择标签循环利用的技术被开发，包括 5-FOA/URA3 负筛选技术和基于重组酶
的负筛选系统。其中，5-FOA/URA3 负筛选技术利用 5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid,5-FOA)对
URA3 阳性酿酒酵母工程菌株具有毒性的特点，来筛选 URA3 阴性酿酒酵母工程菌株(图2C)
[38]。基于重组酶作用的选择标签回收系统同样已经被广泛应用到微生物细胞工程的构建中
[39]，包括来源于酿酒酵母 2μ 质粒的特异性重组系统 FLP/FRT 系统[28]和源自噬菌体P1 的
Cre/lox P 系统[40](图2D)。与 5-FOA/URA3 负筛选技术相比，这两种系统具有更高的编辑效
率。但这两种方法都依赖反向重复序列(Inverted repeats,IRs)，发生重组之后会在基因组中留下
一个重复序列的副本(lox P 或FRT 位点)，在多次重复回收选择标签后导致基因组的不稳定性增
加[41]。为了避免冗余重复序列对后续基因编辑的影响，经突变的FRT 和lox P 位点可避免这
种情况[42]。尽管上述系统很大程度上消除了筛选标签可用性的限制，但由于缺乏在单一转化
步骤中同时引入多个基因修饰的可靠方法，使用筛选标签替代靶基因仍然是一个耗时的过程
[43]。此外，还需在工程菌株中表达相应的重组酶，或者需要携带相应重组酶基因的质粒进行
额外转化并在随后的实验中消除。虽然这些方法的出现提高了细胞工厂构建的效率，但需使用
筛选标签对基因组进行连续修改，并且对基因组进行多目标编辑时并不理想。
图2 经典基因编辑技术
Fig.2 Classic gene editing technology.(A) Homologous recombination connection.(B) Non-
homologous terminal connection.(C) 5-FOA/URA3 negative screening technology.(D) Cre/lox P
technology.
2 、 基于 Meg Ns、ZFNs 和TALENs 的基因组编辑系统
随着基因编辑技术的迅猛发展，早期基因编辑系统已经逐渐被新型基因编辑系统替代。基于核
酸内切酶的基因编辑技术包括归巢核酸内切酶(Meg Ns)技术、锌指蛋白核酸酶(ZFNs)技术
[44]、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)[45]技术和 CRISPR 相关技术[46]等。通过对目标
基因序列造成双链断裂(Double strand break,DSB)，进而对其进行定点基因组编辑。由于DSB
在酵母中具有致命性，因此这些方法理论上可用于无筛选标签修饰，并对目标位点进行精确改
造。
2.1 、Meg Ns 技术
Meg Ns 是具有较大识别位点特征的脱氧核糖核酸内切酶，其可识别超过14 个碱基对的双链
DNA Ⅰ序列，如酿酒酵母中的 -SceⅠ 归巢核酸内切酶可以识别18 bp 的序列[47]。为了实现对目
标基因的编辑，通常需要将归巢核酸内切酶识别位点先引入宿主的染色体目标位置，随后 Meg
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酿酒酵母基因编辑的主要技术成果探究 摘 要：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae是代谢工程中最重要的宿主之一，先进的基因编辑技术已经被广泛应用于酿酒酵母细胞工厂的设计和构建。随着基因编辑技术的飞速发展，早期基于重组酶和同源重组的基因编辑技术逐渐被新型基因编辑系统所替代。文中对酿酒酵母基因编辑技术的原理和应用进行了总结，包括经典的酿酒酵母基因编辑技术，基于核酸内切酶的MegNs、ZFNs和TALENs等基因组编辑系统，最后介绍和讨论了基于CRISPR/Cas系统、异源代谢途径多拷贝整合和基因组规模基因编辑的最新研究进展，并对酿酒酵母基因编辑技术的应用前景和发展方向进行了...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
价格：免费
属性：14 页
大小：1.1MB
格式：DOCX
时间：2024-04-20
